[发明专利]基于环境DNA技术对红耳龟生物量评估的引物及其方法

说明书

本发明公开了一种基于环境DNA技术对红耳龟生物量评估的引物及其方法。本发明所述的方法包括以下步骤：1)通过qPCR技术制作红耳龟DNA浓度与Ct值的标准曲线；2)根据标准曲线测定不同红耳龟放养密度环境下的水体中的红耳龟eDNA浓度；3)将测得的红耳龟eDNA浓度与对应的红耳龟生物量制成相应曲线。结果表明，红耳龟eDNA浓度与其生物量成线性关系，R²为0.9429。本发明提供的方法在实验室环境下可通过检测水体对红耳龟进行快速识别，并且能够根据eDNA浓度评估红耳龟的生物量，为红耳龟的野外分布调查、数量评估及入侵程度等级评估等提供技术支撑。

技术领域：

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种基于环境DNA技术对红耳龟生物量评估的引物及其方法。

背景技术：

环境DNA(environmental DNA，eDNA)是指从环境样品(如水、粪便、土壤、排泄物等)中直接提取到的所有DNA片段集合。从环境样品中直接提取DNA片段后利用各种分子生物学手段对环境中的生物进行定性或定量分析的方法被称为eDNA技术。在水生动物调查研究中，eDNA技术与传统的调查方法相比，具有高效、快速、高灵敏度及对生物体无损伤的特点。近年来，eDNA技术已经在水生生物入侵、珍稀物种监测、生物多样性评估以及生物量估测等方面得到广泛应用。

生物入侵是威胁生态安全的主要因素之一。红耳龟Trachemys scripta elegans是世界上最危险的100个入侵物种之一，该种20世纪80年代被引入中国，目前已在中国野外广泛分布，严重威胁入侵地区的生态安全，并传播高致病性沙门氏菌，对人类健康构成巨大的威胁。快速准确地掌握红耳龟野外分布状况和种群数量是开展入侵防控工作的重要基础。传统龟类分布及种群数量调查以野外动物实体调查为主，耗时费力，效率较低，不利于大规模快速掌握红耳龟的野外入侵状况。因此，本发明专利提供了一种基于eDNA技术来评估水体中红耳龟生物量的方法。

发明内容：

本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种基于环境DNA技术对红耳龟生物量评估的引物及其方法。利用该引物通过荧光定量PCR技术检测不同生物量水体中的红耳龟eDNA浓度，构建水体中红耳龟eDNA浓度与其生物量之间关系的数学模型，为红耳龟野外调查及入侵监测提供新的思路及方法，也为红耳龟野外生物量的评估及入侵程度的估测提供研究基础及技术支撑。

本发明的目的是通过以下的技术方案实现的：

本发明提供的基于环境DNA技术对红耳龟生物量评估的引物是根据红耳龟线粒体DNA基因COI序列而设计的，所述的红耳龟COI碱基数为1542bp，上游引物F：

5'-GGGATGACCAAATCTACAATG-3'，如SEQ ID NO.1所示。

下游引物R：5'-TAATGGCACGAGTCAGTTCC-3'，如SEQ ID NO.2所示。

具体地，所述的基于环境DNA技术对红耳龟生物量评估的方法，包括以下步骤：

(1)提取红耳龟基因组DNA，获得DNA原液，然后将DNA原液进行梯度稀释，以稀释后的DNA作为反应模板，并利用权利要求1所述的引物进行qPCR扩增，制作红耳龟DNA浓度与qPCR反应Ct值的标准曲线；

(2)采集不同红耳龟群体密度环境下的水体样品，采用过滤法提取水体样品中的eDNA，以水体样品eDNA作为模板进行qPCR检测，记录Ct值；

(3)根据步骤(1)得到的红耳龟DNA浓度与qPCR反应Ct值的标准曲线，以及步骤(2)得到的Ct值，计算出红耳龟eDNA浓度；并将红耳龟eDNA浓度与对应的红耳龟生物量制成相应曲线，据此曲线判断水体中红耳龟eDNA浓度与红耳龟生物量之间的关系。