[发明专利]一种宫颈癌筛查检测试剂盒

说明书

发明人提供了一种宫颈癌筛查检测试剂盒，所述试剂盒包括p16/Ki‑67混合一抗，混合酶标二抗和染色液，所述染色液包括AP‑Red染色液和DAB染色液，所述AP‑Red染色液的制备方法，包括色原制备、底物制备、染色液制备。上述技术方案提供了一种新型的宫颈癌筛查检测试剂盒，该试剂盒使用了新配方的AP‑Red染色液，可能是该染色液中的色原具有多个反应基团，这些基团可以和组织上的基团进行反应，形成共价键，使得使用该试剂盒的宫颈细胞薄片可在染色后直接过有机试剂，不需使用水性封片剂封片，避免产生气泡，厚度得到控制，节约了时间和人力成本，避免影响染色结果的观察，提高了检测效率和检测质量。

技术领域

本发明涉及生物医药领域，特征涉及一种宫颈癌筛查检测试剂盒。

背景技术

据不完全统计，中国每年有13万新发病例，2-3万女性可能死于宫颈癌。我国宫颈癌的新发病例占全世界新发病例的28％，中国的宫颈癌防治任重而道远。细胞学检查是目前宫颈癌的主要筛查方法,p16/Ki-67细胞学双重染色是新近发展的宫颈癌筛查技术，其高灵敏度和特异性极大改善了宫颈癌筛查分流管理。

AP-Red染色液是免疫细胞化学中常用的染色液。免疫反应中，抗体所带的碱性磷酸酶与AP-Red染色液起反应，最终使细胞薄片中抗原位点上呈现红色着色。在显色完成后，要对细胞薄片进行封片保存。由于目前普通的AP-Red遇到有机溶剂(乙醇、二甲苯)会褪色，因此需要用水性封片剂封片，若要让染色结果长期保存，待水性封片剂干片后再用中性树胶封片。水性封片剂封片容易产生气泡，有一定厚度，存在折光度问题，一定程度影响染色结果的观察，对检测结果造成不确定性的因素，同时水性封片剂耗时费力，给操作人员增加负担，影响检测的效率。另外，水性封片剂封片后如果没有再次用中性树胶封片，AP-Red的所染的红色会在3-5个月后逐渐褪色。

发明内容

为此，需要提供一种检测简单，提高检测效率和质量的宫颈癌筛查检测试剂盒。

为实现上述目的，发明人提供了一种宫颈癌筛查检测试剂盒，所述试剂盒包括p16/Ki-67混合一抗，混合酶标二抗和染色液，所述染色液包括AP-Red染色液和DAB染色液，所述AP-Red染色液的制备方法，包括以下步骤：

色原制备：3.5-3.7g新品红溶解于45-55ml质量百分比为1.5％-2％的盐酸溶液中，制得第一混合溶液；向第一混合溶液中加入的2-2.2g亚硝酸钠，进行重氮化反应，反应温度控制在0-5℃，得到含有重氮化新品红的第一悬浊液，将第一悬浊液进行固液分离，得到含有重氮化新品红的AP-Red色原溶液；

底物制备：0.2-0.4g萘酚AS-BI磷酸盐溶解于40-60mlpH 8.2-8.6的Tris缓冲液中，得到第二混合溶液，将第二混合溶液与0.4-0.6ml二甲基甲酰胺混合，得到AP-Red底物溶液；

染色液制备：将AP-Red色原溶液与等体积的AP-Red底物溶液进行混合，得到AP-Red染色液。

进一步地，所述色原制备步骤中，所述重氮化反应在冰水浴中进行。

进一步地，所述色原制备步骤中，所述亚硝酸钠在25-35min内缓慢加入。

进一步地，所述底物制备步骤中，Tris缓冲液的质量百分比浓度为18％-25％。

进一步地，还包括加入Tween-20，在所述底物制备步骤中，向第二混合溶液中加入0.14-0.16ml的Tween-20。

进一步地，所述p16/Ki-67混合一抗包括：鼠抗p16单克隆抗体和兔抗Ki-67单克隆抗体，所述混合酶标二抗包括：连接了碱性磷酸酶的羊抗鼠二抗和连接了辣根过氧化物酶的羊抗兔二抗。

进一步地，所述AP-Red染色液在使用前30分钟内由色原溶液与底物溶液配置。