[发明专利]快速检测骨关节感染常见细菌的PCR检测试剂盒及方法

权利要求书

1.一种快速检测骨关节感染常见细菌的PCR检测试剂盒，其特征在于所述试剂盒包括：

引物组，所述引物组包括：金黄色葡萄球菌或耐甲氧西林金黄色葡萄球菌nuc基因引物、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌mecA基因引物、化脓链球菌spyM基因引物和铜绿假单胞菌oprI基因引物。

2.如权利要求1所述的快速检测骨关节感染常见细菌的PCR检测试剂盒，其特征在于，所述nuc基因引物包括如SEQ ID NO:1所示的上游引物序列和如SEQ ID NO:2所示的下游引物序列；

所述mecA基因引物包括如SEQ ID NO:3所示的上游引物序列和如SEQ ID NO:4所示的下游引物序列；

所述spyM基因引物包括如SEQ ID NO:5所示的上游引物序列和如SEQ ID NO:6所示的下游引物序列；

所述oprI基因引物包括如SEQ ID NO:7所示的上游引物序列和如SEQ ID NO:8所示的下游引物序列。

3.如权利要求1或2所述的快速检测骨关节感染常见细菌的PCR检测试剂盒，其特征在于，所述nuc基因引物、mecA基因引物、spyM基因引物和oprI基因引物的上游引物和下游引物的原始浓度分别为9～11μmol/L优选10μmol/L。

4.如权利要求3所述的快速检测骨关节感染常见细菌的PCR检测试剂盒，其特征在于，在所述引物组中，所述nuc基因引物的上游引物和下游引物的体积各为0.3μL，所述spyM基因引物的上游引物和下游引物的体积各为0.15μL，所述mecA基因引物的上游引物和下游引物的体积各为0.4μL，所述oprI基因引物的上游引物和下游引物的体积各为0.3μL。

5.如权利要求1或2所述的快速检测骨关节感染常见细菌的PCR检测试剂盒，其特征在于，所述PCR检测试剂盒还包括多重PCR缓冲液和多重PCR DNA聚合酶混合液，所述多重PCR缓冲液的体积为12.5μL，所述多重PCR DNA聚合酶混合液的体积为0.125μL。

6.如权利要求1或2所述的快速检测骨关节感染常见细菌的PCR检测试剂盒，其特征在于，所述PCR检测试剂盒包括无菌水的阴性对照。

7.如权利要求1或2所述的快速检测骨关节感染常见细菌的PCR检测试剂盒，其特征在于，所述PCR检测试剂盒还包括DNA标记。

8.如权利要求7所述的快速检测骨关节感染常见细菌的PCR检测试剂盒，其特征在于，所述DNA标记是以金黄色葡萄球菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、化脓链球菌、铜绿假单胞菌标准菌株基因组为模板分别采用PCR扩增纯化后的等体积比混合物。

9.一种使用权利要求1或2所述的PCR检测试剂盒快速检测骨关节感染常见细菌的方法，其特征在于包括如下步骤：

步骤S1基于待检测样品上的细菌制备得到PCR模板；

步骤S2在引物组的特异性的结合下根据PCR模板在PCR反应液中进行PCR扩增；

步骤S3对扩增产物进行电泳检测，与DNA标记对比判断是否感染了金黄色葡萄球菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、化脓链球菌和/或铜绿假单胞菌。

10.如权利要求9所述的方法，其特征在于：在步骤S2中，具体PCR反应液包括：12.5μL多重PCR缓冲液，0.125μL多重PCR DNA聚合酶混合液，10μmol/L nuc基因引物的上游引物如SEQ ID NO:1所示和下游引物如SEQ ID NO:2所示体积各0.3μL，10μmol/L spyM基因引物的上游引物如SEQ ID NO:5所示和下游引物如SEQ ID NO:6所示体积各0.15μL，10μmol/LmecA基因引物的上游引物如SEQ ID NO:3所示和下游引物如SEQ ID NO:4所示体积各0.4μL，10μmol/L oprI基因引物的上游引物如SEQ ID NO:7所示和下游引物如SEQ ID NO:8所示体积各0.3μL，8.075μL无菌水和2μL模板；PCR反应条件为94～95℃预变性3～5min；94～95℃下变性15～20s，60～61℃下退火15～20s，72℃下延伸20s，扩增35个循环；72℃延伸5min。