[发明专利]一种检测目标DNA或miRNA的方法

说明书

本发明涉及一种检测DNA的方法，包括以下步骤：S1，提供带有识别序列的DNA四面体探针，形成带有DNA四面体探针的工作电极；S2，将目标DNA与S1中工作电极进行杂交形成带有引发序列的工作电极；S3，将DNA信号探针与S2中引发序列杂交形成带有生物素的工作电极；S4，将带有生物素的工作电极和亲和素修饰的辣根过氧化物酶反应形成带有第一复合体的工作电极；S5，将S4中第一复合体与带有双氧水的3，3’，5，5’四甲基联苯胺水溶液反应输出电化学信号，对目标DNA的浓度进行表征。本发明还涉及一种检测RNA的方法与上述检测DNA的方法，区别在于步骤S2将mi RNA helper的一端与带有DNA四面体探针的工作电极进行杂交，中间与目标miRNA杂交。实现目标DNA或miRNA的高灵敏度检出。

技术领域

本发明涉及核酸检测领域，更具体地涉及一种检测目标DNA或miRNA的方法。

背景技术

微小RNA(miRNA)是一类新发现的长度为19-23个核苷酸的内源性非编码单链小分子RNA，广泛存在于各种生物体的不同器官中，主要是通过特异识别靶信使RNA(mRNA)调控mRNA的表达。对人类基因组的研究表明，miRNA不仅在细胞发育的一系列过程中起着重要的调控作用，而且miRNA的表达与疾病的发生发展有关，尤其值得关注的是与人类多种类型的癌症直接相关(Nature Reviews Cancer,2006，6，259-269)。近来，一些研究发现，miRNA可以在血清或唾液中稳定存在而不被降解(Proc.Natl.Acad.Sci，2008，05，10513-10518)，许多疾病患者的血清或唾液中的一些miRNA的表达明显与正常人不同，加上取材的相对无创性，突显了miRNA作为早期诊断和无创诊断癌症标志物的价值和意义。

无论是基础生物学研究还是癌症的早期诊断和筛选都迫切需要定量检测miRNA的方法，然而由于miRNA在体内的含量极少，序列短，相似性高并且容易被环境中的RNA酶降解等难点使得miRNA的检测一直面临很多的技术挑战。Northern blotting一直被公认为是miRNA检测的黄金标准方法，但是由于它操作繁琐，费时费力，灵敏度相对较低并且样品需要量大(10μg样品)等缺点使得它不适用于常规的临床诊断。定量PCR(qPCR)和微芯片技术也是人们常用的miRNA检测方法，如中国专利CN201010119369.6公开了一种基于荧光定量PCR方法应用特别设计的引物和合成的MGB探针对成熟miRNA进行检测、鉴定的实验试剂设计、制备与技术方法应用；2004年Liu等首次发表了利用微阵列芯片在哺乳动物的不同肿瘤细胞中检测到了245个miRNA，而且被Northern blotting和qPCR所证实(Nature，2005，435，834-838)；中国专利CN101608232A公开了一种新型的微小RNA芯片，用于筛选和检测那些己被鉴定或预测的内源性微小RNA，该方法可以灵敏地检测到细胞/组织中低丰度表达的微小RNA分子，可用于鉴定和比较细胞分化前后微小RNA的变化，以及诊断和评价肿瘤细胞的来源和分化程度。但这些方法常常需要昂贵的仪器和复杂的操作以及对miRNA进行标记等，无法满足miRNA床边检测(point-of-caretests，POCTs)的全部要求，例如不需要标记，不需要放大，在检测非常少的血清样品中miRNA时具有足够高的灵敏度和选择性，能够很好地区分miRNA家族中12碱基的错配，廉价且便携，适用于小型临床或者家庭诊断等。

电化学传感器被认为是最有希望实现POCT的器件，目前己经有一些廉价而且小体积的电化学检测器存在(如基于电化学原理的家用血糖仪)(Nat.Protoc.，2007.2，2888-2895；Nature Chemistry，2011.3,697-703)。但是电化学DNA传感器的灵敏度常常由于异相电极表面的传质过程减慢和表面拥挤效应的影响使探针分子与目标DNA或RNA分子之间很难接触而受限制。目前的电化学传感器检测miRNA的方法需要对miRNA进行电洁性标记，操作步骤比较复杂，并且灵敏度都不高，只能检测pM-fM水平的miRNA，不能满足在不进行PCR前处理情况下直接检测十分微量的miRNA的要求。