[发明专利]产L-鼠李糖的工程菌及其构建方法与应用

说明书

本发明公开了产L‑鼠李糖的工程菌及其构建方法与应用。本发明通过在大肠杆菌中过表达与L‑鼠李糖合成相关基因，增强L‑鼠李糖的合成通路，同时通过旁路途径的阻断，增加了前体L‑乳醛的积累量，开发了一套高效全细胞催化合成游离L‑鼠李糖的方法，首次实现在大肠杆菌中以葡萄糖为单一底物合成L‑鼠李糖。通过这种方式可以以廉价葡萄糖为原料，用大肠杆菌全细胞催化高效合成L‑鼠李糖，不仅合成的鼠李糖为游离态，避免了复杂的水解步骤，可直接用于分离纯化，而且得到的产物中也不含有其他单糖或蛋白质，减轻了后续分离纯化的负担。

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种以葡萄糖为单一底物产L-鼠李糖的基因工程菌及其构建方法与应用。

背景技术

L-鼠李糖是一种甲基戊糖，是L-甘露糖的衍生物，也称6-脱氧-L-甘露糖。在自然界中广泛存在于植物的多糖、糖苷、植物胶和细菌多糖中，其甜度为蔗糖的33％。鼠李糖在工业生产和科学研究中有广泛应用。例如，可以用于测定肠道的渗透性，作为有机物合成的中间体合成香料Furaneol，合成强心药物等。也可以直接用作食品添加剂添加于高档咖啡、饮料、肉类食品中。随着研究开发工作的不断深入，鼠李糖的应用范围将不断扩大。

目前国内外生产鼠李糖的方式主要如下：第一，从天然植物中提取。栎皮酮(橡树)、柚苷(柑橘皮)、维生素P(枥属树皮)等天然物质分子中含有鼠李糖基，可通过水解得到鼠李糖。这一类方法虽然工艺流程清晰，得率较高，但步骤复杂，萃取过程中有毒副产物多，且原材料有限，生产成本高。第二，利用微生物或藻类生产含鼠李糖基的多糖，再水解多糖获得鼠李糖。但是多糖粘性大，影响搅拌，发酵工艺难控制。多糖中鼠李糖含量偏低，水解液中含有多种单糖及杂蛋白，分离提取困难。第三，以微生物发酵生产鼠李糖脂，水解鼠李糖脂得到鼠李糖。绿脓假单胞杆菌、恶臭假单胞杆菌、克雷伯氏菌和乳酸杆菌都可以利用植物油作为碳源生产鼠李糖脂，经水解后获得鼠李糖。这种方法不能水解所有类型的鼠李糖脂，影响了鼠李糖产量。此外，这种方法对酶的要求很高，需要稳定性好、耐鼠李糖脂、适合发酵生产鼠李糖脂的条件、水解特异糖脂键等。综合上述，这三种方法都存在一定的问题，影响了鼠李糖的产率和产量。虽然鼠李糖具有极其重要的经济价值，但目前提取鼠李糖的工艺复杂，副产物多，成本高，产量低，仍没有找到合适的方式大规模工业化生产鼠李糖。

发明内容

本发明要解决的技术问题是如何大规模工业化生产L-鼠李糖。

为了解决上述技术问题，本发明提供了以葡萄糖为单一底物生产L-鼠李糖的方法。

第一方面，本发明要求保护一种产L-鼠李糖的基因工程菌的构建方法。

本发明提供的产L-鼠李糖的基因工程菌的构建方法包括如下步骤：提高大肠杆菌中鼠李树胶糖-1-磷酸醛缩酶和/或果糖-1-磷酸酶和/或L-鼠李糖异构酶和/或甲基乙二醛合酶和/或甘油脱氢酶的含量和/或活性，和/或降低所述大肠杆菌中醛脱氢酶A和/或L-1,2-丙二醇氧化还原酶和/或NADPH依赖的醛还原酶和/或磷酸丙糖异构酶的含量和/或活性。

上述方法中，

所述鼠李树胶糖-1-磷酸醛缩酶的氨基酸序列的genebank号为NP_418338(提交日为08-AUG-2016)；

所述果糖-1-磷酸酶的氨基酸序列的genebank号为NP_417175(提交日为08-AUG-2016)；

所述L-鼠李糖异构酶的氨基酸序列的genebank号为YP_026276(提交日为08-AUG-2016)；

所述甲基乙二醛合酶的氨基酸序列的genebank号为NP_415483(提交日为08-AUG-2016)；

所述甘油脱氢酶的氨基酸序列的genebank号为NP_418380(提交日08-AUG-2016)；