[发明专利]含血管化区和轴突直行髓鞘化区的组织工程脊髓组织构建方法

说明书

本发明涉及一种含血管化区和轴突直行髓鞘化区的组织工程脊髓组织的构建方法。本发明构建的组织工程脊髓组织有3层同心圆分区：最外层圆环为血管化区，中间层圆环为轴突直行髓鞘化区，最内层圆柱体为中间神经元区。构建方法包括：1)将过表达血管生成素‑1的血管内皮细胞种植于明胶海绵支架构建血管化区。2)将过表达睫状神经营养因子的少突胶质前体细胞种植于脱细胞猪视神经支架构建轴突直行髓鞘化区。3)将过表达神经营养因子‑3及其受体TrkC的神经干细胞种植到明胶海绵支架构建中间神经元区。这种体外构建的组织工程脊髓组织移植后能够促进移植物内血管生成，为轴突直行再生、髓鞘和突触的形成创造有利条件，促使移植物长期存活和修复脊髓损伤。

技术领域

本发明涉及医学组织工程学领域，特别涉及了应用生物组织工程技术和干细胞诱导分化技术在体外构建一种含血管化区和轴突直行髓鞘化区的组织工程脊髓组织的方法。

背景技术

脊髓损伤导致神经元和神经胶质细胞大量死亡，形成极度不利于神经再生和修复的微环境。加之内源性神经干细胞(NSCs)来源不足和容易向星形胶质细胞分化加重了空洞和胶质瘢痕形成。因此，脊髓损伤的修复一直是临床治疗中的世界性难题。近十几年来，联合利用干细胞、神经营养因子和生物材料治疗脊髓损伤的组织工程治疗策略已经展示了令人鼓舞的成果。有研究表明，将干细胞负载到含有多种神经营养因子的生物材料中直接移植到脊髓全横断损伤处可能面临着移植干细胞在体内的异常增殖和迁移，以及面临着干细胞分化的不确定性。而单纯移植缓释放神经营养因子的生物材料到脊髓损伤处又面临内源性干细胞不足以修复严重脊髓损伤的问题。如何更安全有效地应用干细胞和组织工程学技术治疗脊髓损伤仍是国内、外学者共同面临的难题。

我们的前期研究基于改善脊髓损伤后不利于神经再生的微环境，和补充大量丢失的神经元和成髓鞘细胞的治疗理念，将过表达神经营养因子3(NT-3)的雪旺细胞和过表达NT-3特异性受体TrkC的NSCs种植于明胶海绵支架，在体外构建具有功能的人工神经网络。结果表明，此类体外预构建的神经网络移植到全横断脊髓损伤处既能够营造有利于神经再生的微环境，促进宿主脊髓自身的神经修复，又能够避免干细胞直接移植在脊髓损伤处的分化不确定性，直接提供了具有突触形成潜能的中间神经元和具有髓鞘修复潜能的成髓鞘细胞[Lai BQ，et al.The integration of NSC-derived and host neural networksafter rat spinal cord transection.Biomaterials，2013，34：2888；Lai BQ，etal.Graft of a tissue engineered neural scaffold serves as a promisingstrategy to restore myelination after rat spinal cord transection.Stem CellsDev，2014，23：910]，在一定程度促进了动物的运动功能恢复。然而，我们前期构建的神经干细胞源性神经网络中，神经元和髓鞘形成细胞的分布是随意和无序的，导致宿主的神经元轴突再生和分布混乱，不能与移植的中间神经元有效地形成突触连接，也不能有效地被髓鞘形成细胞髓鞘化。而我们的前期应用胶原海绵支架和NSCs在体外构建的类脊髓组织，由于胶原海绵本身的孔隙是无规则的，不能模拟正常脊髓白质内少突胶质细胞和神经元轴突的分布，移植到脊髓全横断损伤处不能提供神经元轴突再生的直行通道，降低了宿主神经元轴突直行再生及髓鞘化的效率。

在前期工作中，我们已经制备了脱细胞猪视神经支架，并且验证了该支架具有天然的神经元轴突生长和少突胶质细胞均匀分布生长的直行通道和横向孔道，其结构类似于脊髓的白质，且其移植到全横断脊髓损伤处能够维持2个月不被完全降解。能够很好地为神经元轴突的直行再生提供通道，以及为少突胶质细胞的迁移和对再生轴突的髓鞘化提供孔道，非常适合作为脊髓白质轴突直行再生和髓鞘化支架。

将组织工程脊髓组织移植到脊髓损伤处特别是大动物脊髓损伤处，还将面临的突出问题是移植物的血运建立不足，不能很好地存活和发挥功能。