[发明专利]一种高产L-丙氨酸的基因及其工程菌的构建方法

说明书

本发明涉及生物工程技术领域，具体公开一种高产L‑丙氨酸的基因及其工程菌的构建方法。所述构建方法，包括如下步骤：敲除大肠杆菌染色体的丙氨酸消旋酶基因、D‑乳酸脱氢酶基因及丙酮酸甲酸裂解酶基因；按大肠杆菌密码子偏好，将具有丙氨酸合成能力的L‑丙氨酸脱氢酶基因进行优化处理后，和L‑丙氨酸外运蛋白基因整合到大肠杆菌染色体上；所得到的大肠杆菌进行连续传代培养，得到高产L‑丙氨酸的基因工程菌。本发明提供的高产L‑丙氨酸的基因工程菌的构建方法，提高基因表达效率，增加丙氨酸积累量，提高最终丙氨酸的产量。

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及一种高产L-丙氨酸的基因及其工程菌的构建方法。

背景技术

L-丙氨酸在食品和医药领域有着广泛的用途。在食品领域，L-丙氨酸的添加可明显提高食品及饮料中的蛋白质利用率，食用后能迅速恢复疲劳，振奋精神。L-丙氨酸可提高腌制品的腌制效果并改善风味，提高含醇饮料的质量等。L-丙氨酸具有独特的改善风味效果，它与其它氨基酸配合能加强食品、饮料风味。它还可以改善有机酸的酸味，添加后能使有机酸更接近天然果酸的酸味。在医药领域，L-丙氨酸是合成维生素B6的重要原料，同时也是营养剂补糖氨基酸营养输液的主要成分。由L-丙氨酸组成的复合氨基酸注射液-《14氨基酸注射液-800》是主治肝脑病新药，可治疗肝功能不全时氨基酸代谢紊乱，促使肝昏迷病人苏醒。L-丙氨酸还是一种很好的利尿药。

目前L-丙氨酸的生产是以天门冬氨酸为原料，通过酶催化技术(天冬氨酸脱羧酶)来生产。由于天冬氨酸的生产是以顺酐为原料的，因此L-丙氨酸的生产成本及售价严重依赖于石油价格。而微生物发酵法生产L-丙氨酸和酶催化技术相比有诸多优点：首先，用葡萄糖代替天冬氨酸作为生产原料。酶催化技术以天冬氨酸为原材料。目前天冬氨酸的生产是以顺酐为原料，顺酐的资源紧张和价格高涨导致天冬氨酸的供给也存在着巨大的隐患。微生物发酵法技术是以葡萄糖为原料。葡萄糖属于可再生生物质资源，目前主要是通过玉米淀粉制得，将来可以从木质纤维素中提炼，成本可以长期保持在稳定的水平。利用葡萄糖为原材料，既有很大的价格优势，又能长期维持价格的稳定。

微生物发酵法中大肠杆菌是表达外源基因用于发酵生产有用基因产物的最常用平台微生物之一，丙氨酸的发酵生产以大肠杆菌发酵为主。但是大肠杆菌细胞中丙氨酸的生物合成是在谷氨酰胺-丙酮酸氨基转移酶催化下进行的；此酶催化活性较低，不能满足丙氨酸生产菌株培育的要求，因此，丙氨酸生产菌多采用向大肠杆菌导入具有较强丙氨酸合成能力的编码基因的方法获得。然而，目前丙氨酸生产菌株多采用引入来自革兰氏阳性菌，特别是芽孢杆菌属菌株的高活性L-丙氨酸脱氢酶基因，但它们的GC含量、密码子偏好与大肠杆菌有较大不同，因此直接在大肠杆菌中引入上述基因极有可能因转录与翻译机制的差异造成外源基因表达量降低，进而影响丙氨酸积累。此外，大肠杆菌L-丙氨酸外运蛋白(alaE)编码基因在染色体上只有一个拷贝，不能满足过量丙氨酸的外运而引起丙氨酸胞内积累，最终导致合成途径的反馈抑制而影响产量。

发明内容

针对现有基因工程大肠杆菌中外源基因表达量低，影响丙氨酸积累量，且大肠杆菌L-丙氨酸外运蛋白不能满足过量丙氨酸的外运而引起丙氨酸胞内积累，最终导致合成途径的反馈抑制而影响产量等问题，本发明提供一种高产L-丙氨酸的基因及其工程菌的构建方法。

为达到上述发明目的，本发明实施例采用了如下的技术方案：

一种高产L-丙氨酸的基因，序列如SEQ ID NO.1所示。

相对于现有技术，本发明提供的高产L-丙氨酸的基因，为优化后的L-丙氨酸脱氢酶基因更加符合大肠杆菌的密码子偏好，提高基因表达效率，进而增加丙氨酸积累量，提高最终丙氨酸的产量。

进一步地，本发明还提供了所述高产L-丙氨酸的基因的合成方法，根据大肠杆菌的密码子编码偏好，对具有丙氨酸合成能力的L-丙氨酸脱氢酶基因进行人工合成，将tac启动子和转录终止子rrnBT1加入到合成的L-丙氨酸脱氢酶基因的5'和3'端，并添加5'-UTR，得到高产L-丙氨酸的基因。