[发明专利]一种基因无痕编辑载体及其在生物体基因编辑中的应用

权利要求书

1.一种基因无痕编辑载体，其特征在于：所述的基因无痕编辑载体由基因组同源序列A、启动子序列、细胞壁蛋白CWP1基因序列、抗性筛选报告基因序列和基因组同源序列B组成；

所述的基因组同源序列A的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；

所述的细胞壁蛋白CWP1基因序列的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；

所述的基因组同源序列B的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。

2.根据权利要求1所述的基因无痕编辑载体，其特征在于：所述抗性筛选报告基因为URA营养筛选标记基因、ADE营养筛选标记基因、HIS营养筛选标记基因、TRP营养筛选标记基因、LEU营养筛选标记基因、G418抗性筛选标记基因、KanMX抗性筛选标记基因、Amp抗性筛选标记基因、潮霉素抗性筛选标记基因Hygr、草甘膦抗性筛选标记基因Bar、natMX抗性筛选标记基因或博来霉素抗性筛选标记基因Bleomcin中的任意一种。

3.一种权利要求1所述的基因无痕编辑载体在细胞基因编辑中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述的细胞包括原核细胞和真核细胞。

5.一种基因无痕敲除的方法，其特征在于包括如下步骤：

(1)构建带有Gal-CWP1序列的筛选模板质粒；所述的CWP1序列的核苷酸序列如SEQ IDNo.2所示；

(2)设计带有目的基因上游同源臂序列Ⅰ和下游同源臂序列Ⅲ的引物F，带有目的基因下游同源臂序列Ⅱ的引物R；所述的目的基因上游序列Ⅰ的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；所述的目的基因下游序列Ⅲ的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示；所述的目的基因下游序列Ⅱ的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示；

(3)在模板质粒基础上扩增带有两端同源臂的Gal-CWP1片段，将其通过醋酸锂化学转化法导入到酿酒酵母出发菌株，通过同源重组以实现出发菌株的目的基因突变；

(4)将经过鉴定的发生第一步同源重组的酵母突变株，经含半乳糖的合成培养基平板进行筛选，通过分子内同源重组消除Gal-CWP1片段，最终获得目的基因无痕敲除的酵母突变株。

6.根据权利要求5所述的基因无痕敲除的方法，其特征在于：在步骤(4)中，将经过鉴定的发生第一步同源重组的酵母突变株，经YPG合成培养基平板反向筛选，使含有同源臂片段的Gal-CWP1基因序列再次发生同源重组，丢失Gal-CWP1片段，最终获得目的基因无痕敲除的酵母突变株。

7.根据权利要求5所述的基因无痕敲除的方法，其特征在于：在步骤(4)中，所述的合成培养基为培养酵母菌的YPG培养基。