[发明专利]一种基因无痕编辑载体及其在生物体基因编辑中的应用

说明书

本发明公开了一种基因无痕编辑载体及其在生物体基因编辑中的应用，所述的基因无痕编辑载体由基因组同源序列A、启动子序列、细胞壁蛋白CWP1基因序列、抗性筛选报告基因序列和基因组同源序列B组成。本发明针对酿酒酵母传统基因敲除中筛选标记残留，不便进行多基因敲除研究，以及残留外源基因的问题，提供了一种酿酒酵母高效的基因无痕编辑方法。此方法不仅可以用于酿酒酵母的基因编辑，而且可以适用此基因编辑原理的其它微生物。本发明不仅可用于研究酵母基因的功能和代谢机制，而且所获得的突变株不残留任何外源基因，可以安全的用于工业生产。

技术领域

本发明涉及微生物基因工程领域，具体涉及一种基因无痕编辑的载体及其应用。

背景技术

酿酒酵母作为模式真菌，既具有原核生物生长迅速操作简单的特点，又具有与高等真核生物相似的基因表达调控机制。目前常用的筛选标记基因，如Cre/Loxp系统、5-FOA均属非自身的外源基因，其生产应用受到限制。因此，有必要开发适用于酵母基因无痕敲除技术，以保证不引入任何外源DNA，便于工程菌的实际应用。去除筛选标记的方法主要有两种：一种是利用重组酶介导的敲除系统，例如Cre/Loxp系统，通过转化筛选标记两侧带有重组酶位点的敲除元件到酵母中，经一步整合实现目的基因的敲除，然后转化另一个编码重组酶的质粒，以实现抗性标记的去除。在工业酵母的改造中，这个系统具有很高的效率，但是其仍会留下外源序列(loxp位点)，并且在进行多基因敲除时，留下的这些位点增大了发生染色体重排的可能性。另一种是在目的基因敲除后，利用敲除元件中正向重复序列之间的同源重组。通过这种方法得到的转化子，其基因组的靶位点上，会残留一个重复序列。

CWP1是酿酒酵母细胞壁蛋白1，通过磷酸二酯键与β-1,3-和β-1,6-葡聚糖杂聚物连接到定位于子细胞出生伤痕的细胞壁甘露糖蛋白。CWP1p翻译后经O-糖基化修饰，随后GPI锚定蛋白附着于内质网中的cwp1蛋白上并将其靶向细胞表面，葡糖胺-肌醇磷脂部分被切除，且GPI修饰的甘露糖蛋白通过其无脂GPI聚糖残基共价连接到外部细胞壁层的β-1,6-葡聚糖上。CWP1通过MPK1响应细胞壁摄动的细胞完整性信号传导而受到正向调节，诱导依赖于转录因子RLM1，在厌氧生长过程中下调，由低pH值上调。当Gal启动子高表达CWP1时，细胞形态异常，芽细胞增殖不受细胞调控，致使细胞凋亡。可用此方法筛选出分子内同源重组使Gal-CWP1片段丢失而达到基因无痕编辑的效果。

目前，缺乏一种高效的无痕基因敲除方法。

发明内容

本发明的目的是针对上述问题，提供一种基因无痕编辑载体在生物体基因编辑中的应用及其在废水处理领域中的应用。

为达到上述目的，本发明采用了下列技术方案：本发明的一种基因无痕编辑载体，其特征在于：所述的基因无痕编辑载体由基因组同源序列A、启动子序列、细胞壁蛋白CWP1基因序列、抗性筛选报告基因序列和基因组同源序列B组成；

所述的基因组同源序列A具有SEQ ID No.1的核苷酸序列；

所述的细胞壁蛋白CWP1基因序列具有SEQ ID No.2的核苷酸序列；

所述的基因组同源序列B具有SEQ ID No.3的核苷酸序列。

进一步地，所述的细胞壁蛋白CWP1基因由CWP1基因或其同源基因构成。

进一步地，所述的基因组同源序列A由目的基因上游序列Ⅰ和目的基因下游序列Ⅲ组成，所述序列Ⅰ和序列Ⅲ长度为10-100bp；

所述的目的基因上游序列Ⅰ具有SEQ ID No.4的核苷酸序列；所述的目的基因下游序列Ⅲ具有SEQ ID No.5的核苷酸序列。

更进一步地，所述的基因组同源序列B由目的基因下游序列两段连续序列Ⅱ和Ⅲ组成，所述的序列Ⅱ和序列Ⅲ长度为10-100bp；

所述的目的基因下游序列Ⅱ具有SEQ ID No.6核苷酸序列。