[发明专利]用于定量检测间充质干细胞中Twist-1基因表达量的引物、标准品及检测方法

权利要求书

1.用于定量检测间充质干细胞中Twist-1基因表达量的引物，其特征在于，所述引物包括：

上游引物5′-GTCCGCGTCCCACTAGC-3′；

下游引物5′-TCCATTTTCTCCTTCTCTGGAA-3′。

2.定量检测间充质干细胞中Twist-1基因表达量的质粒标准品，其特征在于，所述质粒标准品通过以下方法制备得到：

提取间充质干细胞的总RNA，然后反转录合成cDNA；

以cDNA作为模板，采用权利要求1所述引物进行PCR扩增，将PCR扩增片段进行回收、纯化，然后克隆到载体中，制得质粒标准品。

3.根据权利要求2所述的定量检测间充质干细胞中Twist-1基因表达量的质粒标准品，其特征在于，所述反转录体系为：总RNA 0.1ng-5μg、浓度为100μM的Oligo(dT)引物1μl、5×Reaction Buffer 4μl、20U/μl的RiboLock RNase inhibitor 1μl、10mM dNTP MIX 2μl、200U/μl的RevertAid M-Mul V RT 1μl，用nuclease-free water补足至20μl；反转录过程为：42℃60min，接着70℃5min。

4.根据权利要求2所述的定量检测间充质干细胞中Twist-1基因表达量的质粒标准品，其特征在于，所述PCR反应体系为：PrimeSTAR Max Premix 25μl、Primer F 3μl、Primer R3μl、cDNA 100-150ng，用nuclease-free water补足至20μl；PCR反应程序为：95℃预变性2min，95℃变性30s，60℃退火15s，72℃延伸10s，共29个循环，最后72℃延伸5min。

5.定量检测间充质干细胞中Twist-1基因表达量的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)提取间充质干细胞的总RNA，然后反转录合成cDNA；

(2)以cDNA作为模板，采用权利要求1所述引物进行PCR扩增，将PCR扩增产物进行回收、纯化，用于制备质粒标准品，并绘制标准曲线；

(3)以待测样品cDNA作为模板，采用权利要求1所述引物对其进行荧光定量PCR反应，得到待测样品的Ct值；

(4)根据标准曲线计算出待测样品中Twist-1基因的拷贝数。

6.根据权利要求5所述的定量检测间充质干细胞中Twist-1基因表达量的方法，其特征在于，步骤(1)中反转录体系为：总RNA 0.1ng-5μg、浓度为100μM的Oligo(dT)引物1μl、5×Reaction Buffer 4μl、20U/μl的RiboLock RNase inhibitor 1μl、10mM dNTP MIX 2μl、200U/μl的RevertAid M-Mul V RT 1μl，用nuclease-free water补足至20μl；反转录过程为：42℃60min，70℃5min。

7.根据权利要求5所述的定量检测间充质干细胞中Twist-1基因表达量的方法，其特征在于，步骤(2)中PCR反应体系为：PrimeSTAR Max Premix 25μl、Primer F 3μl、Primer R 3μl、cDNA 100-150ng，用nuclease-free water补足至20μl；PCR反应程序为：95℃预变性2min，95℃变性30s，60℃退火15s，72℃延伸10s，共29个循环，最后72℃延伸5min。

8.根据权利要求5所述的定量检测间充质干细胞中Twist-1基因表达量的方法，其特征在于，荧光定量PCR反应体系为：FAST Universal 2X qPCR Master Mix 10μl、Primer F 0.8μl、Primer R 0.8μl、template 1μl、ROX-low 0.4μl，用nuclease-freewater补足至20μl；荧光定量PCR反应程序为：95℃预变性3min，95℃变性3s，60℃退火25s，共39个循环。