[发明专利]用于定量检测间充质干细胞中Twist-1基因表达量的引物、标准品及检测方法在审
申请号: | 201810527337.6 | 申请日: | 2018-05-29 |
公开(公告)号: | CN108690877A | 公开(公告)日: | 2018-10-23 |
发明(设计)人: | 刘宇;张蓉;谭遥;黄晓霞 | 申请(专利权)人: | 成都中创清科医学检验所有限公司 |
主分类号: | C12Q1/6883 | 分类号: | C12Q1/6883;C12Q1/686;C12N15/11 |
代理公司: | 成都正华专利代理事务所(普通合伙) 51229 | 代理人: | 李林合 |
地址: | 610041 四川省成都市中国(四川)自*** | 国省代码: | 四川;51 |
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摘要: | |||
搜索关键词: | 引物 间充质干细胞 标准品 基因表达量 待测样品 检测 标准曲线 定量检测 荧光定量PCR反应 扩增产物回收 反转录合成 重复性检测 引物序列 制备质粒 拷贝数 灵敏度 总RNA 绘制 基因 | ||
本发明提供了一种用于定量检测间充质干细胞中Twist‑1基因表达量的引物、标准品及检测方法,该引物序列见SEQ ID No:1和SEQ ID No:2。检测方法包括:提取间充质干细胞总RNA,然后反转录合成cDNA;以cDNA作为模板,采用上述引物进行PCR扩增,将扩增产物回收纯化,用于制备质粒标准品,并绘制标准曲线;以待测样品cDNA作为模板,采用上述引物进行荧光定量PCR反应,得到待测样品Ct值;根据标准曲线计算出待测样品中Twist‑1基因的拷贝数。采用本发明提供的引物、标准品和检测方法对间充质干细胞中Twist‑1基因表达量进行重复性检测,其重复性好,准确性高、灵敏度好,检测时间短。
技术领域
本发明属于生物技术领域,具体涉及一种用于定量检测间充质干细胞中Twist-1基因表达量的引物、标准品及检测方法。
背景技术
Twist-1属于基本螺旋-环-螺旋蛋白家族的一种转录因子,在胚胎发育,尤其是中胚层形成中发挥重要作用。Twist-1基因还参与肿瘤细胞增殖、凋亡、上皮间质转化、肿瘤细胞耐药等生理病理活动。
有研究指出,Twist-1基因的突变会导致指畸形综合症、桡骨发育不全等症状;杂合性Twist-1小鼠,经常出现颅面和四肢的畸形,而且在胚胎发育中容易早期死亡。Twist-1作为上皮间质转化的关键调控因子,对肿瘤的侵袭和转移有重要作用。在乳腺癌的研究中发现Twist-1促进了上皮间质转化的发生,其低表达会阻止转移性肿瘤细胞进入血循环;在横纹肌肉瘤中Twist-1阻止了肌源性分化,通过调节ARF/MDM2/P53途径拮抗P53的凋亡;在黑色素瘤中,转录因子FOXD3通过直接抑制其靶基因Twist-1从而降低了肿瘤细胞的迁移能力;在间变性大细胞淋巴瘤细胞肿瘤中发现Twist-1的高表达,并且其高表达增强了细胞的侵袭力;在转移性黑色素瘤中检测到Twist-1的高表达,并且可以把它作为独立的指标来预测患者的预后。因此,对Twist-1基因的表达水平的监测就尤为重要了,不论是肿瘤标志基因的研究还是临床治疗和愈后判断都具有重要的指导意义。
随着基因表达检测技术的升级换代,对结果的灵敏度、准确度都有了更高的要求,而常规的检测技术就很难满足当今研究的要求了。
发明内容
针对现有技术中存在的上述问题,本发明提供一种用于定量检测间充质干细胞中Twist-1基因表达量的引物及检测方法,该引物及标准品,能够在短时间内对间充质干细胞中Twist-1基因表达拷贝进行绝对定量,且获得的定量数据是高度可重复的,这不仅节约了大量时间,还能够精确、灵敏的监控间充质干细胞中Twist-1基因表达的微小变化。
为实现上述目的,本发明解决其技术问题所采用的技术方案是:
用于定量检测间充质干细胞中Twist-1基因表达量的引物,包括:
上游引物5′-GTCCGCGTCCCACTAGC-3′(SEQ ID NO:1);
下游引物5′-TCCATTTTCTCCTTCTCTGGAA-3′(SEQ ID NO:2)。
定量检测间充质干细胞中Twist-1基因表达量的质粒标准品,该质粒标准品通过以下方法制备得到:
提取间充质干细胞的总RNA,然后反转录合成cDNA;
以cDNA作为模板,采用上述引物进行PCR扩增,将PCR扩增片段进行回收、纯化,然后克隆到载体中,制得质粒标准品。
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