[发明专利]检测多粘菌素耐药基因的多重PCR引物、试剂盒及检测方法

说明书

本发明一方面提供一种检测多粘菌素耐药基因的多重PCR引物，由以下五个引物对组成：SEQ ID No:1和SEQ ID No:2所示的引物对，SEQ ID No:3和SEQ ID No:4所示的引物对，SEQ ID No:5和SEQ ID No:6所示的引物对，SEQ ID No:7和SEQ ID No:8所示的引物对，以及SEQ ID No:9和SEQ ID No:10所示的引物对。本发明还提一种检测多粘菌素耐药基因的检测试剂盒及检测方法。本发明通过在mcr‑1、mcr‑2、mcr‑3、mcr‑4、mcr‑5的基因序列基础上进行引物设计，利用不同PCR产物的大小对相应的耐药基因加以区分。对反应体系及条件加以优化之后，最终确定了一套较为完善的多重PCR反应体系。本发明为同时检测多粘菌素耐药基因—mcr基因家族提供了一套快速、有效的检测方法，本检测方法具有较高的灵敏度和特异性。

技术领域

本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种检测多粘菌素耐药基因的多重PCR引物、试剂盒及检测方法。

背景技术

多粘菌素是一种在临床治疗中使用时间较长的抗生素，其最早于1947年被分离提取，随后进入临床使用。但由于多粘菌素的神经毒性和肾毒性的存在，所以其在临床当中的使用逐渐减少。近年来，随着多重耐药的革兰氏阴性细菌的逐渐增多，多粘菌素被认为是对抗多重耐药革兰氏阴性细菌的“最后一道防线”。

在2016年，中国科学家率先报道了可通过质粒在细菌间水平转移的多粘菌素耐药基因mcr-1，这一发现引起了公共卫生领域的广泛关注，同时也对多粘菌素这个“最后一道防线”构成了巨大的威胁。mcr-1是一种位于质粒或者染色体上编码磷酸乙醇胺转移酶的基因，其可通过编码磷酸乙醇胺转移酶，对革兰氏阴性细菌的细胞膜上的lipid A进行磷酸乙醇胺修饰，进而降低多粘菌素与细胞膜的亲和力产生耐药性。在近几年，在全球超过四十个国家和地区的牲畜和人体当中都检测出了mcr-1基因。与此同时，mcr-2、mcr-3、mcr-4、mcr-5等mcr基因家族的其他基因也陆续被报道出来。传统PCR检测方法往往只能检测mcr-1这一种抗性基因，无法同时对多个耐药基因进行检测，且过程较为繁琐，因此亟需建立一套快速、有效的针对整个mcr基因家族的检测方法。

发明内容

针对现有的检测方法只能检测mcr-1这一种抗性基因的上述问题，本发明提供一种检测多粘菌素耐药基因的多重PCR引物、试剂盒及检测方法，能够对mcr相关抗性基因进行较为全面的检测，大大节省时间、试剂和费用，并且具有较高的灵敏度及特异性。

本发明一方面提供一种检测多粘菌素耐药基因的多重PCR引物，由以下五个引物对组成：SEQ ID No:1和SEQ ID No:2所示的引物对、SEQ ID No:3和SEQ ID No:4所示的引物对、SEQ ID No:5和SEQ ID No:6所示的引物对、SEQ ID No:7和SEQ ID No:8所示的引物对以及SEQ ID No:9和SEQ ID No:10所示的引物对。

本发明另一方面提一种检测多粘菌素耐药基因的检测试剂盒，所述检测试剂盒中包含权利要求1所述的五个引物对。

本发明还提供一种检测多粘菌素耐药基因的多重PCR检测方法，包括以下步骤

(1)配置多重PCR反应体系：1μL待测菌液或50ng左右的质粒DNA为模板，权利要求1所述的五个引物对，每条引物均为3μmol/L，80％甘油1.5μL，2×Taq MasterMix 12.5μL，最后加水补足体积为25μL；

(2)进行PCR扩增，多重PCR反应程序：预变性94℃2min；变性94℃30s，退火56℃30s，延伸72℃1min共25个循环；终延伸72℃2min；

(3)对多重PCR产物进行凝胶电泳检测