[发明专利]棉花遗传转化中产生正常苗的培养基及方法

说明书

本发明公开了棉花遗传转化中产生正常苗的培养基及方法，通过使用无激素的增殖培养基对诱导筛选培养后的愈伤组织进行增殖培养，缩短胚性愈伤组织继代培养时间，增加胚性愈伤组织继代培养透气性，提高分化培养基固化剂含量，胚状体形成后降低培养基中糖含量，进而保证正常苗的产生率达90％以上。

技术领域

本发明涉及技术领域，更具体的说是涉及棉花遗传转化中产生正常苗的培养基及方法。

背景技术

棉花是一种重要的经济作物，然而其种植过程中容易遭受严重病虫害，进而使得每年皮棉产量损失达总产的10％-20％。

随着生物工程技术的发展，研究人员将许多有益的农艺性状、抗病虫和抗逆等性状转化到棉花中，以提高其产量和品质，增加抗虫性、抗病性、抗除草剂和抗逆性，从而提高棉花的种植效率，降低成本，并减轻环境污染。农杆菌介导转化法可以高效地将外源基因整合到棉花基因组中，而外源基因的稳定遗传和高效表达必须以组织培养为基础。棉花体细胞胚发生和再生过程中常伴随着大量的畸形胚和畸形苗，尤其常出现组培苗玻璃化、半玻璃化的现象，这些问题已经成为棉花遗传转化、棉花功能基因的验证和棉花相关基因克隆等研究领域的障碍和瓶颈。

因此，如何减少棉花遗传转化过程中畸形苗的产生是本领域技术人员亟待解决的技术问题。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了棉花遗传转化中产生正常苗的培养基及方法，通过本发明培养基及培养方法，可使正常苗的发生率达90％以上。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

棉花遗传转化中产生正常苗的培养基，所述培养基包括增殖培养基，所述增殖培养基包括如下组分：维生素B18-12mg/L，葡萄糖28-32g/L，Phytagel2.8-3.0g/L和无机盐，pH 6.8；其中，所述无机盐为MS培养基中的无机盐，并且无机盐中的硝酸钾浓度加倍。

优选地，所述培养基还包括分化培养基，所述分化培养基以所述增殖培养基为基础，去掉无机盐中的硝酸铵成分，添加天冬素0.45-0.55g/L，谷氨酰铵0.8-1.2g/L，并且Phytagel浓度为3.5-3.9g/L，葡萄糖浓度为20-25g/L。

优选地，所述培养基还包括成苗培养基，所述成苗培养基以所述分化培养基为基础，并且Phytagel浓度为3.2-3.3g/L，葡萄糖浓度为15-25g/L。

棉花遗传转化中产生正常苗的培养方法，包括以下方法的任意一种或几种：

(1)使用无激素的增殖培养基对诱导筛选培养后的愈伤组织进行增殖培养。

(2)缩短胚性愈伤组织继代培养时间。

(3)增加胚性愈伤组织继代培养透气性。

(4)提高分化培养基固化剂含量。

(5)胚状体形成后降低培养基中糖含量。

二次诱导筛选培养后，将愈伤组织转入增殖培养基时即时抽掉激素可减少畸形苗的数量。胚性愈伤组织在分化培养基上继代培养时间过长会出现愈伤组织褐化死亡和后期畸形苗增加的现象，因此，对胚性愈伤组织继代培养时间进行调整，缩短胚性愈伤组织从体细胞成熟到出苗的时间，可减少褐化死亡和畸形苗的发生。此外，胚性愈伤组织继代培养过程中增加透气性、提高分化培养基固化剂含量，胚状体形成后降低培养基中糖含量均可减少玻璃化、半玻璃化畸形苗的产生。

棉花遗传转化中产生正常苗的培养方法，包括以下步骤：

S1.培育无菌苗，取无菌苗下胚轴切段；

S2.制备浸染液；

S3.使用浸染液侵染下胚轴切段，进行共培养；