[发明专利]一种SKA3基因干扰慢病毒载体及其制备方法

权利要求书

1.一种SKA3基因干扰慢病毒载体，其特征是：所述的载体为人源U6启动子转录的靶向人SKA3基因的shRNA模板序列。

2.根据权利要求1所述的SKA3基因干扰慢病毒载体，其特征是：所述人源U6启动子的序列如SEQ.ID.NO.4所示。

3.根据权利要求1所述的SKA3基因干扰慢病毒载体，其特征是：所述靶向人SKA3基因的shRNA模板序列包括三条，即shRNA-1、shRNA-2和shRNA-3，其中shRNA-1基因序列如SEQ.ID.NO.1所示；shRNA-2的基因序列如SEQ.ID.NO.2所示；shRNA-3基因序列如SEQ.ID.NO.3所示。

4.权利要求1-3中任一项所述的SKA3基因干扰慢病毒载体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

A1：依次用Age I和EcoR I酶切PLKO.1 puro骨架载体质粒，凝胶电泳回收酶切的PLKO.1puro骨架载体质粒，将靶向人SKA3基因的3条不同shRNA模板DNA序列shRNA-1、shRNA-2和shRNA-3分别与凝胶电泳回收的PLKO.1 puro骨架载体质粒连接，获得3个连接产物，取三个含有100μL的DH5α感受态菌液容器，每个容器中加入一种连接产物25μL，混匀，冰浴25分钟；

A2：取步骤A1冰浴后的三种菌液分别置于相应的离心管中，热激90s，之后迅速冰浴3分钟，再向每个离心管中加入LB液体培养基至1mL,在37℃培养箱中复苏60分钟完成转化，获得三种转化的菌液；

A3：取三个含100ug/mL氨苄青霉素的LB琼脂板，在每个LB琼脂板中加入一种转化的菌液100uL，用涂布棒涂布均匀，37℃倒置培养过夜；

A4：从三个过夜培养的LB琼脂板上挑取单克隆菌，扩大培养后提取质粒，质粒进行琼脂糖凝胶电泳鉴定阳性质粒，阳性质粒电泳条带明显滞后于PLKO.1 puro骨架载体质粒；

A5：阳性质粒通过DNA测序验证序列是否正确，序列与预期完全一致的阳性质粒为目的载体质粒，3条不同shRNA模板序列构建的目的载体质粒分别命名为pLKO.1-shSKA3-1,pLKO.1-shSKA3-2和pLKO.1-shSKA3-3。

5.根据权利要求4所述的SKA3基因干扰慢病毒载体的制备方法，其特征在于，步骤A1所述shRNA模板DNA序列需变性退火处理，变性退火处理的方法是使用PCR仪95℃孵育4min，70℃孵育10min，随后缓慢冷却至室温。

6.根据权利要求4所述的SKA3基因干扰慢病毒载体的制备方法，其特征在于，所述目的载体质粒pLKO.1-shSKA3-1,pLKO.1-shSKA3-2和pLKO.1-shSKA3-3转染Hep2细胞，利用Real-time PCR检测SKA3基因的敲降效率。