[发明专利]一种SKA3基因干扰慢病毒载体及其制备方法

说明书

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种SKA3基因干扰慢病毒载体及其制备方法。本发明SKA3基因干扰慢病毒载体，所述的载体为人源U6启动子转录靶向人SKA3基因的shRNA模板序列。本发明的制备方法包括以下步骤：A1：依次用Age I和EcoR I酶切PLKO.1puro骨架载体质粒，凝胶电泳回收，将靶向人SKA3基因的3条不同shRNA模板DNA序列与凝胶电泳回收的PLKO.1puro骨架载体质粒连接，获得3个连接产物；A2：取三种菌液制备获得三种转化的菌液；A3：取三个LB琼脂板，在每个LB琼脂板中加入一种转化的菌液培养过夜；A4：从三个过夜培养的LB琼脂板上挑取单克隆菌，扩大培养后提取质粒，质粒进行琼脂糖凝胶电泳鉴定，阳性质粒电泳条带明显滞后于PLKO.1puro骨架载体质粒；A5：验证序列是否正确。

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种SKA3基因干扰慢病毒载体及其制备方法。

背景技术

细胞分裂周期是一个受到严格调控、保守有序的过程。在细胞有丝分裂过程中纺锤体微管从两极发出分别与姐妹染色单体动粒相连，牵引将姐妹染色单体分别进入子代细胞，这一过程被高度保守的信号机制所调控，这些起关键作用的调控基因通常被称为有丝分裂纺锤体检查基因。SKA复合物为分裂中与动粒关系密切的蛋白质，由SKA1、SKA2、SKA3三个亚基组成，是主要的微管结合因子，负责维持着丝粒和动粒之间的结合。John R.Daum等人通过生物信息学方法分析鉴别出候选蛋白C13orf3/Ska3，并推测SKA3在纺锤体检查点信号传导中具有关键作用。癌症肿瘤一直是人类难以攻克的疾病，癌症标志物的发掘对于未来肿瘤个性化诊断和治疗具有重要的意义，而据现有文献报道，SKA3基因在一些恶性肿瘤转移如前列腺癌转移，将成为新型标志基因，因此，对SKA3基因的基础医学研究具有重要的意义与价值。

发明内容

考虑到现有技术所存在的缺点，本发明提供一种SKA3基因干扰慢病毒载体及其制备方法，制备了SKA3基因干扰慢病毒载体，转染Hep2细胞能使SKA3基因的表达水平显著下调。

本发明为实现上述目的而采取的技术方案为：

一种SKA3基因干扰慢病毒载体，所述的载体为人源U6启动子转录靶向人SKA3基因的shRNA模板序列。

本发明所述人源U6启动子的序列如SEQ.ID.NO.4所示。

本发明所述靶向人SKA3基因的shRNA模板序列包括三条，即shRNA-1、shRNA-2和shRNA-3，其中shRNA-1基因序列如SEQ.ID.NO.1所示；shRNA-2的基因序列如SEQ.ID.NO.2所示；shRNA-3基因序列如SEQ.ID.NO.3所示。

本发明SKA3基因干扰慢病毒载体的制备方法，包括以下步骤：

A1：依次用Age I和EcoR I酶切PLKO.1puro骨架载体质粒，凝胶电泳回收酶切的PLKO.1puro骨架载体质粒，将靶向人SKA3基因的3条不同shRNA模板DNA序列shRNA-1、shRNA-2和shRNA-3分别与凝胶电泳回收的PLKO.1puro骨架载体质粒连接，获得3个连接产物，取三个含有100μL的DH5α感受态菌液的1.5ml离心管，每个离心管分别加入一种连接产物25μL，混匀，冰浴25分钟；

A2：取步骤A1冰浴后的三种菌液分别置于42度水浴锅中，热激90s，之后迅速冰浴3分钟，再向每个离心管中加入LB液体培养基至1mL,置于37℃摇床中，150转每分培养60分钟进行复苏，获得三种转化的菌液；

A3：取三个含100ug/mL氨苄青霉素的LB琼脂板，在每个LB琼脂板中加入一种转化的菌液100uL，用涂布棒涂布均匀，37℃倒置培养过夜；

A4：从三个过夜培养的LB琼脂板上挑取单克隆菌，扩大培养后提取质粒，质粒进行琼脂糖凝胶电泳鉴定，阳性质粒电泳条带明显滞后于PLKO.1puro骨架载体质粒；