[发明专利]一种双靶点DNA纳米治疗体系的构建方法及应用

说明书

本发明属于生物医药技术领域，特别是指一种双靶点DNA纳米治疗体系的构建方法及应用。将六条单链直链DNA溶于体外缓冲盐溶液中，退火自组装形成DNA四面体溶液；向5'端C6氨基修饰的ssDNA溶液中加入交联剂Sulfo‑SMCC粉末，室温反应2h，除未反应的交联剂，然后加入多肽粉末，室温反应12h，去除过量的多肽，即得ssDNA‑peptide；向DNA四面体溶液中加入ssDNA‑peptide，完成双靶点DNA纳米治疗体系的构建。本发明所构建的DNA四面体载体结构稳定，载体载药后可以提高多肽药物的稳定性，并且该双靶点DNA纳米治疗体系靶向性较强，主要通过调控细胞信号通路发挥生物治疗作用。

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，特别是指一种双靶点DNA纳米治疗体系的构建方法及应用。

背景技术

DNA纳米结构具有被动靶向进入病灶区域，克服多药耐药性，增加药物在靶细胞中的滞留时间等优点，而在众多DNA纳米结构中，DNA四面体合成方法简单，所用DNA材料较少，结构刚性较强，并且易于进行修饰。

Fas（CD95）为细胞表面Ⅰ型跨膜（TM）蛋白，是肿瘤坏死因子受体（TNFR）超家族中死亡受体（DR）家族的原型成员，其主要功能是通过特异性地与Fas配体（FasL）结合，进而通过调控相关信号通路而诱导肿瘤细胞凋亡。

研究发现，因癌细胞表面带负电的磷酯酰丝氨酸暴露增加，抗菌肽可以选择性地与癌细胞结合，O-糖基化黏蛋白表达水平的增加、膜电位负值增加、癌细胞膜流动性增加及细胞膜表面积的增加等都可能有助于这种选择性，研究表明来自人体的抗菌肽-LL-37对癌细胞具有较好的抑制作用，对LL-37的功能区进行研究后发现，LL-37的7-27位氨基酸残基通过破坏脂质双分子层结构来发挥其抗菌活性，LL-37多肽N末端1-12位残基对细菌或癌细胞无活性，而17-32位氨基酸残基形成的多肽-FK-16则保留了抗菌及抗癌活性。

将具有Fas配体活性片段的FAS多肽修饰至四面体结构上，通过FAS多肽与细胞膜表面的Fas受体特异性结合形成三聚体、六聚体等而激发Fas/FasL系统，从而激活相关信号通路进而诱导肿瘤细胞的凋亡；亦将同时具有可诱导细胞发生凋亡和自噬的功能性多肽FK-16引入该四面体以协同发挥更好的抗肿瘤作用。在FK-16多肽上修饰细胞穿膜肽（YGRKKRRQRRR）和MMP-2/9酶敏感肽链（PVGLIG）组成具有酶敏感和细胞渗透性的新的功能性多肽-TFM多肽，然后将TFM多肽修饰至四面体结构上。当该载药体系到达肿瘤细胞周围时，MMP-2/9酶敏感肽链可被肿瘤组织周围高分泌的MMP-2/9酶特异性地切断，从而释放出FK-16与细胞穿膜肽的偶联片段（TF多肽片段），在穿膜肽的作用下，TF多肽片段可成功进入细胞从而发挥其自噬与凋亡作用，进一步引起肿瘤细胞死亡。

发明内容

本发明提出一种双靶点DNA纳米治疗体系的构建方法及应用，解决传统药物递送系统存在的技术问题。

本发明的技术方案是这样实现的：

一种双靶点DNA纳米治疗体系的构建方法，步骤如下：

（1）将六条单链直链DNA（S1-S6）溶于体外缓冲盐溶液中，退火自组装形成DNA四面体（TD）溶液；

（2）向5'端C6氨基修饰的ssDNA溶液中加入交联剂Sulfo-SMCC粉末，于pH7-9、磁力搅拌条件下，室温反应2h，经透析去除未反应的交联剂，可得ssDNA-SMCC，然后加入多肽粉末，于pH6.5-7.5、磁力搅拌条件下，室温反应12h，经透析去除过量的多肽，即得ssDNA-peptide产物；

（3）向步骤（1）得到的DNA四面体溶液中加入ssDNA-peptide，以2 min/℃的速度从40℃降至20℃，完成双靶点DNA纳米治疗体系的构建。