[发明专利]一种检测HPS、SS2、Pm、APP的复合PCR试剂盒

说明书

本发明属于生物技术领域的多重PCR检测，具体涉及一种检测HPS、SS2、Pm、APP的复合PCR试剂盒，该试剂盒可检测副猪嗜血杆菌（HPS）、猪链球菌（SS2）、猪产毒多杀性巴氏杆菌（Pm）、猪胸膜肺炎放线杆菌（APP），本发明解决了HPS、SS2、Pm、APP这四种病原菌的混合感染后，临床症状难以区分也难以治疗PRDC的问题，且快速、准确率高，节省了检测时间和成本。

技术领域

本发明属于生物技术领域的多重 PCR 检测领域，具体是一种特异检测副猪嗜血杆菌（HPS）、猪链球菌2型（SS2）、猪产毒多杀性巴氏杆菌（Pm）、猪胸膜肺炎放线杆菌（APP）复合PCR快速检测试剂盒及其应用方法。

背景技术

呼吸道疾病一直是困扰我国养猪业的一大难题，其中副猪嗜血杆菌病、猪链球菌病、猪产毒多杀性巴氏杆菌病、猪传染性胸膜肺炎是目前猪群呼吸道疫病中最主要的细菌传染病。副猪嗜血杆菌病可以引起猪的纤维素性肺炎，关节炎和脑膜炎。猪链球菌病可以引起化脓性脑膜炎、败血症、心内膜炎、肺炎和关节炎等，其中，2型猪链球菌病更是一种重要的人畜共患病，不仅给养猪业带来严重经济危害，还能感染人，严重威胁人类公共卫生安全。猪多杀性巴氏杆菌病可以引起猪肺疫和萎缩性鼻炎。猪胸膜肺炎放线杆菌病具有高度接触性传染性，能引起猪出现出血性、化脓性和纤维素性肺炎。这些疫病多混合感染或者继发于其他病原感染，给养猪业造成严重的经济损失。

副猪嗜血杆菌病、猪链球菌病、猪产毒多杀性巴氏杆菌病、猪传染性胸膜肺炎这几种疫病的临床症状类似，多重感染与激发感染更是给诊断带来困难。现有报道的方法如细菌分离鉴定、免疫组化、补体结合试验，间接血凝试验和ELISA等方法，都是针对其中某一个或其中几个病原菌的检测，能同时检出HPS、SS2、Pm、APP四种病原菌的方法还没有。同时存在耗时长，灵敏度不高的缺点。

多重PCR(complex PCR) 是在同一个PCR反应体系中同时加入了多对引物，而实现在同一体系中对多个目的片段的同时扩增。多重PCR克服了常规PCR方法一次只能扩增一个目的片段的缺点，该方法可同时快速检测多种病原菌，节省了检测成本和时间。

发明内容

针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种检测HPS、SS2、Pm、 APP的复合PCR试剂盒，旨在快速检测HPS、SS2、Pm、APP等猪病病原中的一种或多种，解决临床上混合感染后难以区分的难题。

本发明是这样实现的，一种检测HPS、SS2、Pm、 APP的复合PCR试剂盒，该试剂盒包括：a) PCR反应液、b)10×PCR buffer、c)Taq酶、d)dNTP、e)ddH₂O、f)阳性质控品和阴性质控品；

其中，所述PCR反应液包括：序列为 SEQ ID NO.1 、SEQ ID NO.2的检测副猪嗜血杆菌的上游、下游引物；SEQ ID NO.1：5'-GTGATGAGGAAGGGTGGTGT-3’，SEQ ID NO.2：5'-GGCTTCGTCACCCTCTGT-3’；

序列为 SEQ ID NO.3 、SEQ ID NO.4的检测猪链球菌2型的上游、下游引物；SEQID NO.3：5'-GCAGCGTATTCTGTCAAACG-3’，SEQ ID NO.4：5'-CCATGGACAGAT AAAGATGG-3’；

序列为 SEQ ID NO.5 、SEQ ID NO.6的检测猪产毒多杀性巴氏杆菌的上游、下游引物；SEQ ID NO.5：5'-ATCCGCTATTTACCCAGTGG-3’，SEQ ID NO.6：5'-GCTGTAAACGAACTCGCCAC-3’；

序列为 SEQ ID NO.7 、SEQ ID NO.8的检测猪胸膜肺炎放线杆菌的上游、下游引物；SEQ ID NO.7：5'-AGCCGGGCAAATATTCCAA-3’，SEQ ID NO.8：5'-AAACTA AAACAGCCGCCGA-3’；