[发明专利]一种精氨酸菌种的纯化方法

说明书

本发明属于食品微生物、发酵技术领域，具体地说，是涉及一种缩短精氨酸分纯周期的方法。精氨酸菌种的纯化方法的步骤为：A、配制分纯平板培养基；B、划线分纯：以L‑精氨酸甘油种为出发菌株，用接种环挑环种，放在步骤A的分纯平板培养基上用划线法进行单株分纯，并放到恒温培养箱培养，恒温培养箱的温度为32±0.5℃；C、挑单菌株：培养至48±2h，单株菌落直径达到0.8～1.2mm，用接种环挑选单菌落于斜面培养基中，斜面种放恒温培养箱32±0.5℃培养。本发明分纯平板培养基上单菌落生长速度更快，且对提高发酵产酸水平更有利，能有效改善精氨酸分纯周期长的问题。提高分纯复壮的工作效率，同时降低了培养周期长带来的污染风险。

技术领域

本发明属于食品微生物、发酵技术领域，具体地说，是涉及一种精氨酸菌种的纯化方法。

背景技术

L-精氨酸(L-Arg)是一种半必需碱性氨基酸，是生物体的重要代谢产物，在食品、医药、饲料等行业具有广泛的应用。随着工业生物技术的蓬勃发展，以及对食品和药用氨基酸生产中的“瓶颈”品种——L-精氨酸的新菌种代谢工程及抗产物反馈抑制的分子改造、工艺优化、代谢控制发酵技术等进行了较深入研究，目前微生物发酵法生产L-精氨酸的技术已得到突破，并广泛应用于工业化大生产。

目前，在L-精氨酸发酵工艺优化过程中，精氨酸菌种为经过基因重组技术所得的棒状杆菌，在分纯复壮环节，精氨酸平板培养基中菌落生长缓慢，需培养72小时菌落直径才达适于挑单株的0.8～1.2mm大小。菌落生长缓慢导致精氨酸分纯周期长，这不但不利于工业化大生产的高效运作，同时也给防污染工作带来一定隐患。

发明内容

针对上述菌落生长缓慢导致精氨酸分纯周期长的技术问题，本发明提供一种精氨酸菌种生长快促使精氨酸分纯周期短的精氨酸菌种纯化方法。

为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案是：一种精氨酸菌种的纯化方法，步骤为：A、配制分纯平板培养基；B、划线分纯：以L-精氨酸甘油种为出发菌株，用接种环挑环种，放在步骤A的分纯平板培养基上用划线法进行单株分纯，并放到恒温培养箱培养，恒温培养箱的温度为32±0.5℃；C、挑单菌株：培养至48±2h，单株菌落直径达到0.8～1.2mm，用接种环挑选单菌落于斜面培养基中，斜面种放恒温培养箱32±0.5℃培养。所述步骤A的培养基配方为：配方为牛肉膏1.0±0.1％、酵母粉1.0±0.1％、蛋白胨0.5±0.05％、氯化钠0.5±0.05％、琼脂2.0±0.2％、葡萄糖1.0±0.1％、尿素0.25±0.02％、组氨酸0.03±0.002％，PH7.0。通过在分纯平板培养基中添加可被菌种快速利用的C源(葡萄糖)、N源(尿素)以及组氨酸，改善原配方中可供菌体生长的速效C源、N源不足问题，有效地提高了分纯平板培养基中菌落生长的速率，同时通过添加组氨酸提高菌种表达能力，确保分纯单株的产酸率不会降低。此发明有效地缩短精氨酸分纯周期24小时，采用本发明所挑新单菌株上摇瓶发酵试验，产酸率的高低波动幅度更小且多集中在高水平段。

进一步：在上述精氨酸菌种的纯化方法中，所述的步骤A是将培养基用纯化水溶解，水浴加热至融化，定容后调PH为7.0，121±1℃灭菌20±2分钟，待培养基冷却至50±2℃，按无菌操作法倒入平板平置，凝固后放32±2℃培养箱预孵24±2小时。所述的按无菌操作法倒入平板平置是指按无菌操作法倒2只平板平置，所述平板培养基装量是15±1ml。所述的步骤B中划线法是指将平板皿作分区标记，在平板皿底划分成A、B、C、D四个面积不等的区域，各区之间的交角应为120±10℃。