[发明专利]一种免疫细胞的储存方法及细胞冻存液

权利要求书

1.一种免疫细胞冻存液，其特征在于，所述的免疫细胞冻存液按体积百分比包含以下组分：40％～75％1640培养基、20％～45％胎牛血清和8％～20％二甲基亚砜。

2.根据权利要求1所述的免疫细胞冻存液，其特征在于，所述的免疫细胞冻存液按体积百分比包含以下组分：45％～65％1640培养基、25％～40％胎牛血清和10％～20％二甲基亚砜。

3.根据权利要求1所述的免疫细胞冻存液，其特征在于，所述的细胞冻存液的配制顺序为：首先，将一定比例的1640培养基和胎牛血清混合，摇匀，然后将所需体积的二甲基亚砜一滴一滴加入配好的1640-胎牛血清混合培养基中，边滴边摇，让三者充分混合，得到所需培养基。

4.一种免疫细胞储存方法，其特征在于，包含以下步骤：

S1.通过常规无菌操作抽取新鲜外周血，并将上述外周血与1640培养基进行对倍稀释摇匀，形成稀释液，再将稀释液与适量的淋巴细胞分离液混合；

S2.随后将上述混合液进行离心，使其形成分层，离心完成后，吸取白膜层中的单个核细胞，再补充适量的1640培养基，并打匀；

S3.将上述溶液进行离心，离心结束后，弃上清液，保留沉淀，并加入适量的1640培养基，并摇匀；

S4.随后将上述溶液进行离心，弃上清液，再次保留沉淀，并加入适量的1640培养基，并摇匀，并离心；

S5.离心结束后，弃上清液；往细胞沉淀中补充适量的1640培养基，摇匀；再吸取细胞悬浮液并用台盼蓝染料进行染色和计数；

S6.按照1*10⁷/ml的细胞冻存密度，将外周血单个核细胞分装到冻存管当中，再往里加入权利要求1-2任一项所述的细胞冻存液，并摇匀；

S7.将冻存管放到程序冻存盒中降温，并在-80℃超低冰箱过夜；随后，再将冻存管转入液氮罐中冻存。

5.根据权利要求4所述的一种免疫细胞储存方法，其特征在于，所述的离心要求为：

S2步骤的离心要求为2000rpm，20～22min，22℃，上下加速度均调为0；

S3步骤的离心要求为1500rpm，8～12min，4℃，上下加速度均调为9；

S4步骤的离心要求为1000rpm，3～7min，4℃，上下加速度均调为9。

6.根据权利要求4所述的一种免疫细胞储存方法，其特征在于，所述的S1步骤中的外周血和培养基的稀释液与淋巴细胞分离液混合要求为将外周血与培养基的稀释液添加到淋巴细胞分离液中，添加时需将稀释液缓慢匀速滴加到淋巴细胞分离液之上，确保稀释液和淋巴细胞分离液形成明显分层。

7.根据权利要求4所述的一种免疫细胞储存方法，其特征在于，还包括以下步骤：将复苏后的细胞悬液加入到装有一定体积的1640完全培养基的离心管中，1000rpm，10min，4℃离心计数，并按一定密度钟板或培养瓶，以培养细胞因子诱导的杀伤细胞和树突状细胞。

8.根据权利要求7所述的一种免疫细胞储存方法，其特征在于，所述的树突状细胞培养基为1640培养基、胎牛血清、谷氨酰胺、人类重组细胞因子、IL-4和TNF-α。

9.根据权利要求8所述的一种免疫细胞储存方法，其特征在于，所述的人类重组细胞因子为GM-CSF。