[发明专利]一种医用细胞修复剂的制备方法

权利要求书

1.一种医用细胞修复剂的制备方法，其特征在于，具体的制备步骤为，

(1)海藻酸钠复合剂的制备

称取1～10g无水海藻酸钠，加入到100ml玻璃瓶中，接着加入40ml去离子水均匀搅拌至溶解，再加入20ml甘油混匀，然后加入40ml的无血清间充质干细胞培养基充分混匀；再往玻璃瓶中添加表皮生长因子EGF1mg、碱性成纤维细胞生长因子bFGF2mg、血管生长因子VEGF2mg，搅拌均匀后得到海藻酸钠复合剂；

(2)细胞修复剂的制备

向1ml步骤(1)制得的海藻糖复合剂中加入1.0×10⁶细胞/ml人羊膜间充质干细胞悬液1ml，再加入1ml质量浓度为1％的透明质酸钠液，搅拌均匀后即得细胞修复剂；

人羊膜间充质干细胞的制备步骤为，

步骤1：分离纯化

取无菌采集羊膜组织，生物安全柜内置于预冷的PBS中冲洗，若胎盘连带绒毛膜，需先分离绒毛膜和羊膜，取出羊膜，丢弃绒毛膜；剪羊膜组织为2cm×2cm的羊膜小条，等体积加入2U/ml中性蛋白酶消化30min，再加两倍半羊膜体积的5.5mg/mlV型胶原酶和2U/ml透明质酸酶1：1混合液消化3.5h；收集消化完毕的细胞悬液，加入无钙镁离子的平衡液多次清洗，冰醋酸稀释后计数单个核细胞，得出细胞总量；

调整细胞浓度至于1.0×10⁵个/ml，加入无血清间充质干细胞培养基，置于37℃，浓度为5％CO₂，饱和湿度的培养箱中培养,每2d换液1次，一周后得到原代羊膜间充质干细胞；待细胞生长至培养容器底面积的80-90％时,大量细胞团连成片时，以浓度0.05％g/L胰蛋白酶消化后传代，将细胞置于铺有L-多聚赖氨酸的培养瓶中进行传代培养，得到传代的羊膜间充质干细胞；

步骤2：冻存前对细胞进行质量检测

a.对细胞收集前的培养液进行传染病病原体检测，包括乙肝、丙肝、梅毒、艾滋病原体；

b.在细胞冻存的同时，取细胞进行微生物培养，进行微生物检测；

步骤3：选取商品化无血清细胞冻存液，将5×10⁶个/ml的人羊膜间充质干细胞加到1ml冻存液中，放入冻存管中，先置于冰箱中，4℃下保存8min，再调至-80℃下保存12-18h，然后放入配有液氮罐的人羊膜间充质干细胞库中；

步骤4：根据新生儿性别和ABO/Rh分型及HLA分型保存，建立细胞信息档案，构建出人羊膜间充质干细胞库。