[发明专利]一种医用细胞修复剂的制备方法

说明书

本发明涉及修复创伤的药剂，尤其是涉及一种医用细胞修复剂的制备方法。具体的制备步骤为，人羊膜间充质干细胞的分离纯化和培养，海藻酸钠复合剂的制备，细胞修复剂的制备。本发明建立了人羊膜间充质干细胞制备方法和相应的干细胞库，为较大规模生产制备人羊膜间充质干细胞修复剂及其应用做好了准备。

技术领域：

本发明涉及修复创伤的药剂，尤其是涉及一种医用细胞修复剂的制备方法。

背景技术：

皮肤创伤修复是一个复杂的生物学过程，它启动一系列复杂的生物学事件,包括炎症、组织新生及组织重构。虽然许多研究采用不同的方法治疗皮肤创伤修复，但愈合质量低、附属器官不可再生等依然是皮肤创伤愈合过程中的关键问题。目前，皮肤移植是修复大面积皮肤损伤的最有效方法。近年来，人工合成皮肤已经被用来治疗皮肤损伤，但并不是一种完美的皮肤替代物，也存在着一系列的问题：目前使用的人工合成皮肤种子细胞是自体或异体的表皮细胞。自体表皮细胞数量不足，异体表皮细胞则存在着排异反应；目前使用的人工合成皮肤中存在着活细胞，但是保存是个问题，若临时制备需要时间较长，而皮肤损伤需要在尽快的时间内使用人工合成皮肤；目前使用的人工合成皮肤不具有创面新生皮形成血管的能力，容易坏死。而间充质干细胞已经被证实是皮肤创伤修复的有效种子细胞。

已有诸多实验研究结果证实BMSCs在促进创面愈合方面起到积极的作用。Badiavas将骨髓间充质干细胞移植到深II度烧伤创面,发现其明显促进创面的愈合。付小兵等将BMSCs移植至猪深度烧伤创面，发现创面愈合速度明显加快，表皮增厚，真皮神经纤维增多，大大改善了创面愈合质量。文献报道BMSCs还参与表皮、汗腺及创面血管的重建。这些研究结果表明BMSCs是非常好的皮肤组织工程种子细胞。创伤愈合的各个阶段都有生长因子的参与和调控，生长因子对治疗慢性难愈合皮肤创口和大面积烧伤创面有着广阔的应用前景。但是作为临床应用，获得骨髓间充质干细胞时手续比较复杂，提供者比较痛苦。此外，骨髓来源的间充质干细胞是随着提供者年龄的增加，其数量会减少，相应的分化能力也会变弱。近年来，发现胎盘附属组织来源的干细胞，尤其是羊膜间充质干细胞，是骨髓间充质干细胞很好的替代品。2004年，IntAnker等从羊膜培养出的人羊膜间充质干细胞(hAMSCs)，其免疫表型与骨髓间充质干细胞(BMSCs)相似，且其比BMSCs具有更强的扩增能力。hAMSCs不但具有干细胞特征，而且表现出低免疫源性和免疫抑制作用，是较为理想的免疫赦免细胞，是皮肤创伤修复的有效种子细胞。它不仅更原始，生长能力强，而且排异反应也较小。羊膜组织本是医疗废弃物，来源广泛而且易得。

申请号为200810136415.6的发明专利公开了一种使用甲基纤维素作为细胞基质的人脐带间充质干细胞创面涂抹剂的制备方法，但是该发明含有抗生素庆大霉素，不适用于抗生素过敏人群；人脐带间充干细胞的使用没有配型，可能会有排异反应，而且涂抹剂快速配制中含有动物源成分胎牛血清，有可能造成过敏以及具有动物源性安全隐患。

发明内容：

本发明正是针对上述问题，提供了一种医用细胞修复剂的制备方法。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案，具体的制备步骤为，

1、海藻酸钠复合剂的制备

称取5g无水海藻酸钠，加入到100ml玻璃瓶中，接着加入40ml去离子水均匀搅拌至溶解，再加入20ml甘油混匀，然后加入40ml的无血清间充质干细胞培养基充分混匀；再往玻璃瓶中添加表皮生长因子EGF 1mg、碱性成纤维细胞生长因子bFGF 2mg、血管生长因子VEGF2mg，搅拌均匀后得到海藻酸钠复合剂；

2、细胞修复剂的制备

向1ml步骤1制得的海藻糖复合剂中加入1.0×10⁶细胞/ml人羊膜间充质干细胞悬液1ml，再加入1ml质量浓度为1％的透明质酸钠液，搅拌均匀后即得细胞修复剂。

人羊膜间充质干细胞的制备步骤为，

(1)分离纯化