[发明专利]一种嗜中性粒细胞的富集分离方法

权利要求书

1.一种嗜中性粒细胞的富集分离方法，其特征在于，具体过程如下：

1)用第一注射器向闭鳔类鱼体的鱼鳔内注射大肠杆菌灭活菌液后，继续培养；

2)用第二注射器沿原注射孔向步骤1)所得闭鳔类鱼体的鱼鳔内注射HBSS，轻轻颠倒鱼体；

3)用第三注射器从闭鳔类鱼体的原注射孔中抽出嗜中性粒细胞悬液。

2.根据权利要求1所述的嗜中性粒细胞的富集分离方法，其特征在于，所述步骤1)中，闭鳔类鱼体在注射前经过室内养殖观察以排除鱼体携带病原的可能，所述室内养殖的条件如下：隔天换水约1/3，溶氧保持在5.0mg/L以上，pH 7.0～8.0，水温30±2℃，每天投喂饲料两次，每次投喂饲料质量约为鱼体质量的3％。

3.根据权利要求1所述的嗜中性粒细胞的富集分离方法，其特征在于，所述步骤1)中，大肠杆菌灭活菌液的配制过程如下：

A)大肠杆菌菌种解冻并培养，长出菌落后挑取单菌落培养至稳定期；

B)培养的菌液离心收集菌体，用PBS缓冲液洗涤菌体；

C)重悬菌液再次离心收集菌体，加入2mg/mL福尔马林重悬菌体灭活，灭活时间为18-24小时；

D)灭活菌液离心收集菌体并称重；菌体用HBSS悬浮，浓度控制为5mg/mL。

4.根据权利要求3所述的嗜中性粒细胞的富集分离方法，其特征在于，所述步骤1)中，大肠杆菌灭活菌液的配制过程如下：

A)冻存保存的大肠杆菌菌种常温解冻并在固体培养基上划线培养，长出菌落后挑取单菌落置于液体培养基培养至稳定期；

B)培养的菌液置于冷冻离心机在≥4000r/min 4℃条件下离心10分钟，去除上清，收集菌体，用50-100mL预冷的PBS缓冲液洗涤菌体；

C)重悬菌液再次于冷冻离心机在4000r/min 4℃离心10分钟，去除上清，收集菌体，加入20-50mL福尔马林重悬菌体灭活18-24小时；

D)灭活菌液置于冷冻离心机在≥4000r/min 4℃条件下离心10分钟，去除上清，收集菌体并称重；菌体用HBSS悬浮，浓度控制为5mg/mL。

5.根据权利要求1所述的嗜中性粒细胞的富集分离方法，其特征在于，所述第一注射器为1mL一次性注射器；

所述大肠杆菌灭活菌液的注射量为每50g鱼体注射0.2mL。

6.根据权利要求1所述的嗜中性粒细胞的富集分离方法，其特征在于，所述闭鳔类鱼体为罗非鱼；所述步骤1)中注射的位置为罗非鱼侧线鳞上一排鳞片的第二个鳞片。

7.根据权利要求1所述的嗜中性粒细胞的富集分离方法，其特征在于，所述原注射孔是指步骤1)中第一注射器注射后在鱼体上留下的孔。

8.根据权利要求1所述的嗜中性粒细胞的富集分离方法，其特征在于，所述步骤1)中继续培养的条件如下:注射后的鱼放回25-30℃水温的鱼缸继续培养12-24小时。

9.根据权利要求1所述的嗜中性粒细胞的富集分离方法，其特征在于，所述第二注射器为5mL一次性注射器；

所述HBSS的注射量为0.8-2mL；所述HBSS是指100单位/mL HBSS中加入肝素的HBSS溶液；

所述步骤2)中轻轻颠倒鱼体的次数约2～10次。

10.根据权利要求1所述的嗜中性粒细胞的富集分离方法，其特征在于，所述第三注射器为装有50mL切平的注射器针头的5mL注射器。