[发明专利]一种嗜中性粒细胞的富集分离方法

说明书

本发明提供一种嗜中性粒细胞的富集分离方法，具体过程如下：1)用第一注射器向闭鳔类鱼体的鱼鳔内注射大肠杆菌灭活菌液后，继续培养；2)用第二注射器沿原注射孔向步骤1)所得闭鳔类鱼体的鱼鳔内注射HBSS，轻轻颠倒鱼体；3)用第三注射器从闭鳔类鱼体的原注射孔中抽出嗜中性粒细胞悬液。本发明通过在鱼鳔内注射灭活菌液趋化嗜中性粒细胞，诱导嗜中性细胞趋化募集到鳔中，分离出数量多且单一的嗜中性粒细胞，方法简单高效，所得嗜中性粒细胞纯度高，为探究嗜中性粒细胞的趋化作用机制、嗜中性粒细胞的吞噬和分泌作用机制、巨噬细胞与嗜中性粒细胞的协同抗炎杀菌作用以及嗜中性粒细胞与病原菌的免疫互作机制的研究提供线路。

技术领域

本发明涉及生物细胞技术领域，具体涉及一种嗜中性粒细胞的富集分离方法，尤其是闭鳔鱼类嗜中性粒细胞的富集分离方法。

背景技术

硬骨鱼类，大多数都有鳔。鱼鳔的体积约占身体的5％左右。鱼鳔位于体腔背方的长形薄囊，内含空气，通过鱼鳔肌调节鱼鳔的收缩和膨胀可以使鱼在水中上升或下沉。鳔有一根鳔管与食道相通，称为喉鳔，属较低等的硬骨鱼类的鳔，如鲤鱼。无鳔管的鳔，称为闭鳔，闭鳔由一个完全闭合的膜形成的小气室组成，属高等硬骨鱼类的鳔，如罗非鱼、大口黑鲈、花鲈等。

嗜中性粒细胞呈圆形，胞质淡红色。胞核幼稚型的呈杆状或马蹄形，成熟的呈分叶状，三叶的较多见。嗜中性粒细胞来源于骨髓的造血干细胞，在骨髓中分化发育后，进入血液或免疫组织。嗜中性粒细胞绝大部分分布在骨髓和结缔组织，血液中的数量分布占比只有2％，但在血液中嗜中性粒细胞的数量约占白细胞总数的55％以上，其在杀灭异物病原中发挥强大的防御作用。

当病原菌入侵宿主某部位时，感染部位特异定居的巨噬细胞等免疫细胞释放大量趋化因子，吸引中性粒细胞向感染部位聚集，募集而来的中性粒细胞受细菌产物、抗原抗体复合物等作用时，细胞的颗粒内容物向细胞外释放。释出的酸性蛋白酶和中性蛋白酶，可以分解血管基膜、肾小球基膜、结缔组织的胶原蛋白与弹性蛋白以及血浆中的补体C5、C15和激肽原等。这些释放的分解产物有的又是中性粒细胞趋化因子，能继续吸引募集更多的中性粒细胞和其他免疫细胞，形成复杂的趋化因子网络系统。巨噬细胞与中性粒细胞在炎症部位的相互招募和聚集促进了吞噬细胞间的协同合作，这不仅能增强它们的杀菌作用，而且能促进感染性炎症的恢复。

炎症部位定居的巨噬细胞和募集而来的中性粒细胞，通过固定的模式识别受体(PRRs)识别病原菌细胞内保守的病原相关分子模式(PAMPs)。中性粒细胞的片足与产生趋化因子的异物接触后，接触处周围的胞质形成隆起，将异物包围，形成含有异物的吞噬体或吞噬泡。嗜中性粒细胞膜表面有IgGFc受体和补体C3受体，可加速吞噬作用。细胞随着吞噬作用的开始，导致细胞膜紊乱而引起呼吸爆发，细胞耗氧量增加，产生大量的过氧化物及超氧化物等细胞毒性效应分子，对寄生虫具有杀伤活性。在IFN-γ和TNF刺激下，则可产生更多的过氧代谢阴离子，杀死胞外病原。中性粒细胞在杀死吞噬的细菌等异物后，本身也死亡，死亡的中性粒细胞则成为脓细胞。

因此，如何高效的富集分离到嗜中性粒细胞，尤其是从闭鳔鱼类中得到高纯度的嗜中性粒细胞，具有重要的意义。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供一种嗜中性粒细胞的富集分离方法，通过在鱼鳔内注射灭活菌液趋化嗜中性粒细胞，诱导嗜中性细胞趋化募集到鳔中，分离出数量多且单一的嗜中性粒细胞，方法简单高效，所得嗜中性粒细胞纯度高。

为解决上述问题，一方面，本发明在于提供一种嗜中性粒细胞的富集分离方法，具体过程如下：

1)用第一注射器向闭鳔类鱼体的鱼鳔内注射大肠杆菌灭活菌液后，继续培养；

2)用第二注射器沿原注射孔向步骤1)所得闭鳔类鱼体的鱼鳔内注射HBSS，轻轻颠倒鱼体；

3)用第三注射器从闭鳔类鱼体的原注射孔中抽出嗜中性粒细胞悬液。