[发明专利]一种肿瘤靶向性载体pcTERT及其构建方法及其应用

说明书

本发明涉及一种肿瘤靶向性载体pcTERT及其构建方法及其应用，属于基因工程领域。该载体以pcDNA3.1质粒为基础，以筛选获得的最佳长度的人端粒酶逆转录酶启动子hTERT启动子替代其原有的CMV启动子，在其后可连接不同种类的肿瘤杀伤性基因序列，使用转染试剂将重组载体转染到不同种类肿瘤细胞，在体内及体外实验中均取得了一定的肿瘤杀伤作用。一种有效的可供外源基因在肿瘤部位靶向表达的非病毒载体，有望在肿瘤的基因治疗中实现应用。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种含hTERT启动子的用于肿瘤靶向基因治疗的载体、载体构建及其应用。

背景技术

近年来恶性肿瘤的发病率持续升高，已成为威胁人类健康的第二大类疾病，全世界每年约有13％的人数死于恶性肿瘤，中国也有60％以上的癌症死亡率。随着环境的恶化、工作压力加大、不良生活的方式以及世界人口老龄化，这一数字也将继续上升，据WHO估计，2007年到2030年间，新发癌症病例将由2007年的1130万例激增到2030年的1550万例，给家庭和社会造成无法弥补的损失。而目前临床上传统的手术、放疗和化疗等治疗方法和手段其效果难以令人满意。

手术和放疗为局部性的治疗，对肿瘤的复发与转移作用有限，化疗虽然为全身性的治疗手段，但是缺少靶向性，对人体健康细胞的伤害难以避免，Murray JC发表文章报道仅2％～5％到达肿瘤部位，大于90％药物被正常组织吸收，造成很大的毒副作用。因此开发靶向性的肿瘤治疗药物十分迫切。

目前肿瘤的靶向性治疗药物研究主要集中在以下几方面：1、针对与肿瘤细胞分化增殖相关的细胞信号转导通路的关键酶(蛋白酪氨酸激酶、芳香化酶、拓朴异构酶等)为靶点，选择性作用于特定靶位的高效、低毒、特异性强的小分子化合物。2、抗体靶向药物。是利用单抗对肿瘤表面相关抗原或特定受体特异性识别，从而把药物直接导向肿瘤细胞，提高药物的疗效，降低药物对循环系统及其它部位的毒性。根据其结构，抗肿瘤单克隆抗体类可以分为抗肿瘤单克隆抗体药物和抗肿瘤单克隆抗体偶联物。其中抗肿瘤单克隆抗体药物能结合到肿瘤细胞，通过直接的抗原抗体反应导致细胞死亡。抗肿瘤单克隆抗体偶联物，又称免疫偶联物，由单抗与“攻击”肿瘤的成分(化学药物、放射性核素、光敏剂、酶等)2部分偶联构成。3、靶向性给药载体系统。利用该系统药物可通过特殊载体或修饰基团的作用特异性地浓集于靶部位。这些特殊载体包括脂质体、纳米粒、胶束和纳米囊等，修饰基团包括抗体、糖蛋白、脂蛋白、转铁蛋白、多肽类、叶酸等。4、靶向性基因治疗。使用特异的载体系统将治疗基因靶向性导入肿瘤细胞是目前国内外肿瘤靶向治疗的研究热点，也是很有可能获得突破性成果造福人类的领域之一。

为了实现靶向性基因治疗，需要将目的基因通过某种手段定向导入特定的组织、细胞或使其在某些特定的组织细胞中表达，从而准确消除肿瘤细胞，同时不损伤正常细胞，或尽量减少对正常细胞的损伤，以减轻由于外源基因导入带来的副作用，这除了在固定的有限的肿瘤部位进行治疗外，还要求治疗中使用的目的基因具有转移的靶向性以及在其转移后能靶向性的表达等。随着对载体研究的深入，人们发现单一通过载体很难满足靶向性的需要，而对于肿瘤特异性启动子的研究可以很好的填补运用单一载体的不足。正常细胞内由于并不含有该特异性转录激活因子，因而导入这些细胞中的治疗基因并不表达。关于特异性启动子报道较多的有：

酪氨酸酶(Tyrosinase，Tyr)启动子：Tyr表现为特异地表达于黑色素瘤细胞，其基因由Tyr启动子通过特异地方式进行表达。如Swoboda等使用Try启动子与细胞周期依赖性抑制基因(cyclin-dependent kinase inhibitor，CDKN2A)结合，实现基因在小鼠黑色素瘤中的特异性表达。

存活素(survivin)启动子：存活素属于抑制凋亡蛋白，其具有肿瘤特异性。存活素启动子在肝癌的治疗中可以通过介导核苷酸探针发挥作用，还可以通过在其下游连接肿瘤杀伤基因，通过在肿瘤细胞内启动该杀伤基因表达起到有效灭杀肿瘤细胞的作用。