[发明专利]一种快速检测溶血性曼氏杆菌的LAMP引物组及其应用

说明书

本发明公开了一种快速检测溶血性曼氏杆菌的LAMP引物组及其应用，属于动物细菌学及分子生物学技术领域。所述LAMP引物组如SEQ ID NO：1~5所示；所述LAMP引物组用于制备检测溶血性曼氏杆菌的LAMP试剂盒，该试剂盒提供的LAMP检测方法具有高度的特异性和敏感性，重复性好，可信度高，特异性检测出溶血性曼氏杆菌的特异性核苷酸片段，并且可对溶血性曼氏杆菌拷贝数进行定量检测，快速准确的获得检测结果，为简便、快速地检测溶血性曼氏杆菌带来便利，本发明解决了传统鉴别方法分离率低，耗时费力等不足，适合基层使用，可作为溶血性曼氏杆菌实验室快速检测和流行病学调查的一种快速、准确、简便的检测工具。

技术领域

本发明涉及动物细菌学及分子生物学技术领域，具体涉及一种快速并且可实时定量检测溶血性曼氏杆菌的LAMP引物组及其应用。

背景技术

溶血性曼氏杆菌（Mannheimia haemolytica ）属于巴氏杆菌科，为革兰阴性的球杆菌，是存在于牛、绵羊、山羊等反刍动物以及其他多种动物上呼吸道的常在菌和机会致病菌。在某些诱发因素作用下，溶血性曼氏杆菌可导致上述动物引发致死性肺炎。病毒和支原体的感染使得机体溶血性曼氏杆菌更易感，如副流感病毒及绵羊肺炎支原体等。此外，环境骤变、运输等造成的机体应激以及动物整体健康状况降低均可以使这两种细菌引发呼吸道疾病或影响疾病的严重程度。目前，溶血性曼氏杆菌在全球范围内均有分布，给养牛业、养羊业造成了重大的经济损失。在临床上，溶血性曼氏杆菌和多杀性巴氏杆菌不仅可以单独感染，两者也可以继发感染或混合感染，且引起的呼吸道症状相似，这为采取针对性的防治措施带来困难。

目前，溶血性曼氏杆菌的检测技术主要有常规方法和分子生物学方法。常规方法是传统的病原分离鉴定，即通过对细菌的表型特征和生化指标进行鉴定，常规鉴定方法费时费力，此外，溶血性曼氏杆菌和多杀性巴氏杆菌在形态大小、染色特性等方面也很相似，从而为这两种细菌的准确鉴定造成不便。因此，建立一种可以快速、准确检测和鉴定溶血性曼氏杆菌的方法具有重要的应用价值。

发明内容

本发明的目的是提供一种快捷准确检测鉴别溶血性曼氏杆菌的方法，公开一种快速、实时定量检测溶血性曼氏杆菌的LAMP引物组及其应用。为实现本发明目的所使用的技术方案为：

一种快速检测溶血性曼氏杆菌的LAMP引物组，所述LAMP引物组由具有SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示核苷酸序列的内引物FIP和BIP、具有SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示核苷酸序列的外引物F3和B3、具有SEQ ID NO:5所示核苷酸序列的环引物LB组成。

优选的，所述LAMP引物组是依据溶血性曼氏杆菌gcp基因进行设计。

优选的，所述LAMP引物组在制备检测溶血性曼氏杆菌试剂盒的应用。

本发明还提供一种快速检测溶血性曼氏杆菌的LAMP试剂盒，所述LAMP试剂盒包括SEQ ID 1~5所示的核苷酸序列。

优选的，所述LAMP试剂盒还包括以下组分：

（1）2×反应缓冲液：包含Buffer、dNTPs、Mg²⁺

（2）Bst DNA聚合酶

（3）超纯水

（4）阳性对照：溶血性曼氏杆菌DNA。

优选的，所述的引物组使用浓度为25 pmol/μL。

优选的，所述LAMP试剂盒的反应程序为63℃恒温保持60 min，扩增结束后85℃灭活5 min，反应在20-25 min出现扩增。

结果判定：