[发明专利]检测血液中氯硝西泮含量的在线固相萃取液相色谱分析方法

权利要求书

1.一种检测血液中氯硝西泮含量的在线固相萃取液相色谱分析方法，其特征在于：它包括以下步骤：

（一）标准溶液的标定

首先用移液枪将至少三种不同浓度的标准工作液10μL、10μL标准内标液和190μL空白血清分别置于1.5ml离心管中混合制成至少三种标准溶液，上述标准溶液分别在转速为1000-2000rpm下涡旋混匀30s-1min后，加入含有0.2mol/L硫酸锌甲醇溶液的沉淀剂200μL，并在转速为1200-2000rpm下涡旋混匀2-4min后，再在转速10000-15000rpm下高速离心4-6min后，得到上清液，分别取上述上清液200uL，用高效液相色谱仪和DVD检测器对上述上清液进行检测，分别得出上述至少三种标准溶液中的氯硝西泮色谱图和2-萘酚色谱图，以上述至少三个标准溶液的氯硝西泮峰面积与2-萘酚峰面积之比作为标准曲线图的纵坐标y，以上述标准工作液中含有氯硝西泮的浓度与标准内标液中含有2-萘酚浓度之比作为标准曲线图的横坐标x，将以上检测所得至少三组数据进行线性回归，拟合得到标准曲线方程为y=a*x + b，并且得出权重系数a和b，标准工作液是含有氯硝西泮的溶液，标准内标液是含有2-萘酚的溶液；

（a）标准工作液的配制：

精确称取氯硝西泮标准品1.58mg置于2mL容量瓶中，用2mL甲醇进行溶解，得到标准储备液A，其氯硝西泮的浓度为790ug/mL，将标准储备液A用含水量为10%-40%体积比的甲醇溶液的沉淀液进行沉淀，分别在含有200-4000ng/mL氯硝西泮的范围内配制出各浓度的标准工作液，并在-80℃条件下保存；

（b）标准内标液的配制

精确称取2-萘酚标准品2.04mg于2mL试管中，用2mL甲醇进行溶解，得到内标储备液B，其2-萘酚浓度为1020 ug/L，将内标储备液B用含水量为10%-40%体积比的甲醇溶液的沉淀液进行沉淀，得到含有2-萘酚浓度为50ug/L的标准内标液，并在-80℃条件下保存，

在步骤（a）和（b）中的沉淀液是由3:7的水和甲醇组成的沉淀液；

（二）检测血液的离心

取待检测血液至少5ml，在离心速度为3500rpm下离心10min，得到上清液即血清，将上述血清置于-20℃冷冻下保存至分析前备用；

（三）待测样品处理

（c）用移液枪移取步骤（b）的标准内标液10uL于1.5ml的离心管中，然后加入步骤（二）的200uL的血清于上述离心管中, 在离心速度为1500-2500rpm下离心30s-1min；然后在上述离心管中加入含有0.2mol/L硫酸锌甲醇溶液的沉淀剂200μL，并在转速为1200-2000rpm下涡旋混匀2-4min后，再在转速10000-15000rpm下高速离心4-6min后，得到上清液即为待测样品；

（四）待测样品的检测

移取步骤（c）待测样品200uL，使用高效液相色谱仪和DVD检测器对上述待测样品进行检测，得出上述待测样品的氯硝西泮色谱图和2-萘酚色谱图，将上述色谱图中的氯硝西泮峰面积和2-萘酚峰面积之比y代入上述步骤（一）的标准曲线方程y=a*x + b中，通过计算得到待检测样品中氯硝西泮浓度与标准内标液中2-萘酚浓度之比x，标准内标液中2-萘酚浓度是已知的，通过计算得到待检测血液中的氯硝西泮药物浓度；

所述高效液相色谱仪还包括：在线固相萃取装置，在线固相萃取装置所使用的萃取柱为SHISEIDO，MF-Ph-1 S-5(NNJV)；

所述高效液相色谱仪所使用的分析色谱柱为Waters，Sunfire® C18，所使用的在线过滤器为SSI COL PRE-FILTER WATER 1/16 0.5M，高效液相色谱仪设置的柱温为50℃，进样量为100uL；

所述在线固相萃取装置的萃取柱流动相为水，萃取柱流速为2.0mL/min，萃取柱采用反冲模式；

所述分析色谱柱的流动相含有20:12:68比例的乙腈：甲醇：水，分析色谱柱流速为0.6mL/min，分析色谱柱采用等度洗脱方式；

所述DVD检测器为Vanquish 二极管阵列检测器，其检测波长为330nm。