[发明专利]检测血液中氯硝西泮含量的在线固相萃取液相色谱分析方法

说明书

本发明检测血液中氯硝西泮含量的在线固相萃取液相色谱分析方法是使用高效液相色谱仪和DVD检测器对标准溶液进行标定，拟合得到标准曲线方程为y＝a*x+b，取待测血液样品，在该待检测血液经过处理后，同样使用高效液相色谱仪和DVD检测器对待测的样品进行检测，得到待测血液y值，将待测血液y代入标准曲线方程中，通过计算得到待测血液样品中氯硝西泮相对浓度x，内标物工作液浓度是已知的，由此计算得到该样本中待检测血液中的氯硝西泮药物浓度，本发明血清经沉淀离心后直接进样，使检测过程简便快速，实验成本降低，更利于在临床治疗中对患者体内的氯硝西泮血药浓度进行监测。

技术领域

本发明涉及精神类药物的临床血药浓度监测技术领域，尤其涉及一种检测血液中抗癫痫抗惊厥药物氯硝西泮浓度的方法。

背景技术

癫痫是常见的神经系统疾病，有突然、反复发作的特点，目前临床上首选药物治疗。氯硝西泮是广谱的抗癫痫药物，用于控制各型癫痫发作，对失神发作、婴儿痉挛症、肌阵挛性及运动不能性发作疗效较好。也可用于药物引起的注意缺陷障碍(多动症)和各种神经痛的治疗。其口服后通过胃肠道后，在血液中循环的活性化合物为氯硝西泮。氯硝西泮(Clonazepam，CZP)，分子式为C₁₅H₁₀ClN₃O₃，具体化学结构如下图1所示。氯硝西泮的有效血药浓度参考区间：20.00～70.00ng/mL(抗惊厥)4.00～80.00ng/mL(抗焦虑催眠)，当血药浓度＞100ng/mL时，毒副作用增强。常见不良反应有动作不灵活、步态不稳、嗜睡，共济失调及行为紊乱如激动、兴奋、不安、出现攻击行为等；少见的有视力模糊、便秘、腹泻、眩晕或头昏、头痛、气管分泌物增多或流涎、恶心、呕吐、排尿障碍、语言不清、口干。氯硝西泮主要通过神经系统发挥其药理作用，由于其治疗窗较窄，体内代谢过程存在较大的个体差异，服药周期长，给药剂量和血药浓度相关性不稳定，而血药浓度与疗效及毒性反应相关，用药剂量不足与药物过量的临床症状相似，所以对其血药浓度的监测是调整剂量，减少不良反应的重要参考，在临床用药中具有重大意义。

目前常用的氯硝西泮血药浓度的测定方法众多，各有优缺点，包括高效液相色谱法、气相色谱法、液相色谱串联质谱法等。气相色谱法检测时对样本先进行衍生化处理，此前处理过程较为繁琐。液相色谱串联质谱法测定血药浓度具有灵敏度高、专属性强等优点，成本较高，且对人员和环境的要求较高。高效液相色谱法定量准确，重现性好，且经济效益好，但目前仍存在前处理复杂，分析时间较长等问题。

发明内容

针对上述技术问题，本发明目的是提供一种检测血液中氯硝西泮药物浓度的方法，使氯硝西泮血药浓度的测定快速准确，很大程度上缩短样本分析时间。

本发明采用的技术方案是：

本发明的一种检测血液中氯硝西泮含量的在线固相萃取液相色谱分析方法，其中：它包括以下步骤：

(一)标准溶液的标定

首先用移液枪将至少三种不同浓度的标准工作液10μL、10μL标准内标液和190μL空白血清分别置于1.5ml离心管中混合制成至少三种标准溶液，上述标准溶液分别在转速为1000-2000rpm下涡旋混匀30s-1min后，加入含有0.2mol/L硫酸锌甲醇溶液的沉淀剂200μL，并在转速为1200-2000rpm下涡旋混匀2-4min后，再在转速10000-15000rpm下高速离心4-6min后，得到上清液，分别取上述上清液200uL，用高效液相色谱仪和DVD检测器对上述上清液进行检测，分别得出上述至少三种标准溶液中的氯硝西泮色谱图和2-萘酚色谱图，以上述至少三个标准溶液的氯硝西泮峰面积与2-萘酚峰面积之比作为标准曲线图的纵坐标y，以上述标准工作液中含有氯硝西泮的浓度与标准内标液中含有2-萘酚浓度之比作为标准曲线图的横坐标x，将以上检测所得至少三组数据进行线性回归，拟合得到标准曲线方程为y＝a*x+b，并且得出权重系数a和b，标准工作液是含有氯硝西泮的溶液，标准内标液是含有2-萘酚的溶液；

(a)标准工作液的配制：