[发明专利]引物5’端反向互补的荧光PCR

权利要求书

1.引物5'端反向互补的荧光PCR，其特征是一对引物5'端添加一段序列反向互补的荧光PCR扩增，带来扩增产物间末端互补，靶产物3'末端间也可以互为模板、互为引物而增加扩增效率，以＞2ⁿ级数放大策略而增敏；另一面引物5'端互补不会延伸反而抑制原引物对3'末端间的聚合非特异性，联合3'最末端倒数第1-2个碱基A/a腺嘌呤结尾的引物+UDG酶解dU代替dT的扩增产物,和矿物油封闭来杜绝产物尤其引物二聚体PD气雾胶污染，具有如以下技术途径：

(1)一对引物5'端均加上一段短于引物长度2-5b的反向5-10b互补人工序列，根据扩增产物链3'末端与引物互补并而为下一轮循环反应模板的现象，一对5'互补引物扩增产物链3'末端间相应地也互相互补，扩增产物3'末端不仅为后续循环结合引物的模板，产物3'末端人工序列间也可以互为模板、互为引物结合、延伸，放大效率超过＞2ⁿ指数或几何级数，实现增强PCR扩增灵敏度；

(2)利用引物5'自身的序列作为“人工互补序列”，将一条引物5'端序列对应的5-8b反向互补序列按5'-3'方向加到另一条引物5'端前面，反之，另一条引物5'端的反向互补序列加一段至对应引物5'前面，形成两段连续5'反向互补序列而增敏，原引物与添加序列共用了一段引物5'自身序列，原引物序列与添加的序列间可插入一短4b序列限制酶切位点，使增敏PCR产物酶切后长度一致以便于电泳回收和有助于降解PD产物污染。

2.根据权利要求1所述的引物5'端反向互补的荧光PCR，其特征在于：所述上下游原引物具有中部6-8b同序/相同碱基序列A结尾的引物，用于进一步减少引物二聚体程度/推后引物二聚体本底扩增Ct值；加入引物中部互补的反义碱基5-9b中部干扰Oligo寡核苷酸增效剂，选择性抑制PCR反应内的引物二聚体扩增本底Ct值。

3.根据权利要求1所述的引物5'端反向互补的荧光PCR，其特征在于：所述原引物中部6-8b同序A结尾引物的尾碱基A前或后紧邻碱基变一个RNA，让A结尾和RNA碱基联合共同消化引物二聚体PD产物污染。

4.根据权利要求2所述的引物5'端反向互补的荧光PCR，其特征在于：所述的引物设计在常规引物选取基础上修改和增补一些减少本底、5'端反向互补引物设计原则：

(1)选取一对靶特异性基因跨度100-300bp两端序列17-22个核苷酸碱基长度作为上下游引物，且引物3'末端间不能有连续反向互补；

(2)选取靶基因跨度300bp以内6-8b“倒置重复”置于一对引物离3'端2-6个碱基以外的中部作为中部同序引物；

(3)5'端反向互补—采用5-7b对侧原引物5'反向序列作为添加人工序列加至相对引物前面，人工添加的序列与原引物序列间插入一短4b序列限制酶切位点；

(4)一对引物的3'最末碱基选择A/AC结尾使扩增产物对应dU位于二聚体的原引物连接中间处；不要选氢键强“错配”多的G结尾,亦不要选氢键弱/特异性差的T结尾,更不能采用重复双GG/TT结尾。

5.根据权利要求1所述的引物5'端反向互补的荧光PCR，其特征在于，所述的引物浓度为3-6μM作为50×倍或终浓度0.1μM，随不同样本最低浓度检测要求及系统本底值需要调整最佳引物浓度。

6.根据权利要求1所述的引物5'端反向互补的荧光PCR，其特征在于：PCR反应液添加含甜菜碱和聚阴离子多聚磷酸通用PCR增效剂，双向增强靶扩增效率和抑制PD非特异性扩增。

7.根据权利要求1所述的引物5'端反向互补的荧光PCR，其特征在于：联合矿物油密闭PCR反应情况下采用一成分如一引物含10％蔗糖分层缓慢释放-结合热启动PCR以减少气雾胶产量或产生无效扩增气雾胶。