[发明专利]引物5’端反向互补的荧光PCR

说明书

引物5'端反向互补的荧光PCR，属于分子生物学‑核酸扩增技术领域，其特征是一对引物5'端添加一段序列反向互补的荧光PCR扩增，带来扩增产物间末端互补，靶产物3'末端也可以互为模板、互为引物而增加扩增效率，在常规PCR指数放大10^9‑12基础上再增加灵敏度50倍，或同样灵敏度情况下可少扩增5个循环；另一面引物5'端互补不会延伸反而抑制原引物对3'末端间的聚合非特异性或少扩增5个循环可避开引物非特异扩增区。联合中部同序与3'最末端倒数第1‑2个碱基A腺嘌呤结尾的引物+UDG酶解dU代替dT的扩增产物,和矿物油密闭使PCR反应循环内无引物二聚体PD产生及杜绝产物气雾胶交叉污染。

技术领域：

本发明属于分子生物学及核酸检验的荧光PCR技术领域，具体地增加引物5'端互补序列以超过指数放大来提高灵敏度和限制引物非特异性的单管一步法实时荧光PCR。

背景技术：

多聚酶链反应PCR是在1953年Watson建立的DNA双螺旋模型及半保留复制法则基础上，体外(试管内)模拟自然基因复制的核酸扩增技术，早在1971年Khorana就已发表了一核酸体外扩增(J.Molec.Biol.,56:341)相关论文；但直到1985年美国Cetus公司Mullis想到了PCR本质-指数扩增或几何级数式放大的巨大威力,才发明了一对特异引物结合、复制靶分子基因,模拟天然DNA半保留复制的PCR技术，再经过一系列发展和耐热聚合酶、热循环仪的发明、应用，Cetus公司于1987年申请了首个PCR发明专利(US Patent 4,683,202)。

扩增利用热循环高效解链，一般经高温变性：靶DNA经94℃使双链解离成为单链；退火复性：降温至54℃左右使过量引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；引物延伸：升温至72℃左右，DNA单链模板—引物结合物在耐热DNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，遵循碱基反向配对复制，引物末端按5'→3'方向延伸、合成一条新的与模板DNA链反向互补的复制链，子代一半新链一半母链半保留复制；不断重复循环变性--退火--延伸三过程，这种新链又可成为下次循环的模板，靶分子以2ⁿ级数产生更多的新链。

各种PCR方法，改进不断涌现,发明，包括反转录RT-PCR,原位PCR,连接酶链反应(LCR)，标记PCR(Labeled primers-PCR)，反向PCR(reverse PCR)，不对称PCR(asymmetricPCR)，降落PCR(touchdown PCR)，重组PCR(recombinant PCR)，多重PCR(multiplex PCR)，免疫-PCR(immuno-PCR)，mRNA差异PCR，链替换扩增(SDA)，依赖核酸序列的扩增(NASBA)，转录依赖的扩增系统(TAS)，Qβ复制酶(Q-beta replicase)催化RNA扩增,滚环扩增(RCA),环介导的等温扩增(LAMP)等。由于常规终末PCR因同样量的样本经PCR超级放大以后变化太大而产量不均一，致使难以定量检测，传统的终末/终点PCR只能PCR后凝胶电泳来区分特异与非特异扩增条带；1997年采用动态实时检测扩增对数期的循环数与靶初始量成反比(反对数关系)的实时荧光PCR(Real-time PCR)技术实现了从定性测定到精确定量的飞跃，根据发光原理有以SYBR Green Ⅰ等结合产物DNA双链小沟后使发射荧光增强1000倍的染料法实时荧光PCR和各种荧光标记杂交探针实时PCR两大类(Bio Techniques 1997,22:130-138)。