[发明专利]一种高产5-氨基乙酰丙酸生产菌株的构建方法及应用

说明书

本发明公开了一种高产5‑氨基乙酰丙酸生产菌株的构建方法及应用，本发明以酿酒酵母by4741为宿主，通过克隆高活性酿酒酵母5‑ALA合成酶hem1基因，将hem1基因克隆进入表达载体Prs426。启动子选择组成型启动子TDH3P。此含有hem1基因的质粒线性化后，通过电转化方式转入酿酒酵母。得到的转化子即为本发明方法所需的基因工程菌株。并将菌株用于5‑ALA的生产和动物饲料的添加。本发明的有益效果是：首次将5‑ALA合成酶基因成功导入到真核细菌酿酒酵母当中，在之前的研究当中未有报道。构建的高产5‑ALA重组酿酒酵母，得到5‑ALA的产量达到2.0 g/L，和其他研究相比，5‑ALA的产量相对较高。构建的高产5‑ALA重组酿酒酵母，可以应用于微生物发酵饲料行业中，具有无污染、绿色环保等特点。

技术领域

本发明涉及一种高产5-氨基乙酰丙酸生产菌株的构建方法及应用，属于基因工程和微生物发酵技术领域。

背景技术

5-氨基乙酰丙酸(5-aminolevulinic acid，5-ALA)，是一种含氧和氮的碳氢化合物，作为血红素、叶绿素和维生素B12等四吡咯类化合物必需前体物质, 是一种广泛存在于细菌、真菌、动物及植物等生物机体活细胞中的非蛋白质氨基酸，是动植物生命活动必需的、代谢活跃的生理活性物质，可以通过生物途径合成，也可以人工化学合成，没有毒副作用，易降解无残留。在农业、医药和化工领域应用广泛，是极具开发价值的高附加值生物基化学品。5-ALA可以通过化学合成法和生物发酵法制备，而清洁高效的生物发酵法逐步成为研究和开发的重点，并已经得到了产业化应用。

目前ALA的生产菌株主要是通过诱变育种或基因工程改造获得原核细菌，如大肠杆菌、谷氨酸棒状杆菌等，通过基因工程改造酿酒酵母菌的研究在国内外鲜有报道。而且根据2013年我国农业部2045号公告《饲料添加剂品种目录》中规定在饲料以及饲料添加剂中可用的35种微生物菌株种类，大肠杆菌、谷氨酸棒状杆菌这两种菌均不在列。

发明内容

为了克服上述缺陷，本发明提供了一种高产5-氨基乙酰丙酸生产菌株的构建方法及应用。本发明的主旨是通过重组表达外源5-ALA合成酶，弱化琥珀酸合成酶的活性，改变细胞自身的代谢途径，从而构建出新的工程菌株来绿色生产5-ALA；另一方面，将新菌株通过固体发酵生产的微生物发酵饲料，添加到动物饲料中饲喂断奶仔猪，能显著提高断奶仔猪的生长性能和血液中各项指标的含量。

为了实现上述目的，本发明的技术方案是：在第一方面，本发明提供了一种高产5-氨基乙酰丙酸生产菌株的构建方法，弱化5-氨基乙酰丙酸生产菌株中琥珀酰辅酶A的合成途径关键酶的活性。

优选的，所述琥珀酰辅酶A的合成途径关键酶是琥珀酸合成酶。

优选的，所述弱化是指将琥珀酸合成酶的活性降低为原始活性的40-60%。

进一步优选的，所述弱化是指将琥珀酸合成酶的活性降低为原始活性的48-50%，最优值为48.17%。

优选的，所述5-氨基乙酰丙酸生产菌株为酿酒酵母。

优选的，将酿酒酵母中5-氨基乙酰丙酸合成酶hem1基因克隆进入表达载体Prs426；启动子选择组成型启动子TDH3P；此含有hem1基因的质粒线性化后，通过电转化方式转入酿酒酵母；得到的转化子即为高产5-氨基乙酰丙酸酿酒酵母工程菌株。

在第二方面，本发明提供了一种高产5-氨基乙酰丙酸生产菌株，所述5-氨基乙酰丙酸生产菌株中琥珀酰辅酶A的合成途径关键酶的活性得到弱化。

优选的，所述琥珀酰辅酶A的合成途径关键酶为琥珀酸合成酶。

在第三方面，本发明提供了一种生产5-氨基乙酰丙酸的方法，从上述的5-氨基乙酰丙酸生产菌株的发酵培养体系中获得5-氨基乙酰丙酸。