[发明专利]一种提高酵母mRNA表达效率的方法在审

专利信息
申请号: 201810546546.5 申请日: 2018-05-31
公开(公告)号: CN110551750A 公开(公告)日: 2019-12-10
发明(设计)人: 王海勇;杨柳;谭永水;刘新利 申请(专利权)人: 齐鲁工业大学
主分类号: C12N15/81 分类号: C12N15/81;C12N15/67;C12N15/31;C12R1/865;C12R1/84
代理公司: 12209 天津盛理知识产权代理有限公司 代理人: 韩晓梅
地址: 250353 山*** 国省代码: 山东;37
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摘要:
搜索关键词: 异源蛋白表达 核糖体蛋白 定向进化 关键因子 合成步骤 酵母表达 酵母宿主 浓度限制 异源表达 游离核糖 重组蛋白 核糖体 酶制剂 突变体 野生型 再利用 异源 酵母 修饰 基因 开发
【说明书】:

发明涉及一种提高酵母mRNA表达效率的方法,所述方法利用定向进化手段获得核糖体蛋白合成步骤中关键因子RLI1突变体,对野生型RLI1基因进行相同修饰,加速核糖体再利用速率,进而增加了异源蛋白表达效率。本发明针对酵母表达酶制剂或重组蛋白时,异源mRNA含量受胞内游离核糖体浓度限制而开发,本方法可显著提高酵母宿主的异源表达水平。

技术领域

本发明属生物工程技术领域,涉及提高酵母酶制剂或重组蛋白的表达效率,尤其是一种涉及核糖体蛋白合成过程的关键因子编码基因RLI1的修饰而提高酵母mRNA表达效率的方法,特别是一种提高酵母mRNA表达效率的方法。

背景技术

随着后基因组时代的到来,重组蛋白的异源表达备受关注。国内外关于提高真核细胞异源表达效率的研究报导很多。总体策略上可以概括为以下几个方面:

1、增加基因的拷贝数

通过运用高拷贝数质粒或直接在基因组上增加基因的拷贝数进行异源基因的克隆表达,如利用pYES2载体及pPIC9k载体高整合拷贝数工程菌筛选等;

2、将异源基因置于强启动子控制下,带来高峰度的mRNA,进而为翻译提供足量的模板,提高异源基因的表达水平,如GAL1、PGK1及AOX1等启动子的应用;

3、优化异源基因的编码序列,使其与宿主的密码子使用偏好一致,如通过;

4、改变mRNA非编码区的序列,使其更适合宿主翻译系统;

5、与宿主内源性肽段进行融合或共表达,增加异源基因表达水平,如与分子伴侣共表达提高蛋白折叠效率,进而提高表达水平;

6、对宿主信号转导途径进行调控,如对未折叠蛋白质反应信号通路进行改造等;

7、对分泌及降解途径进行工程改造,主要针对酿酒酵母种分泌特性较差的宿主。

但无论是那种策略,在宿主细胞内大量合成某种蛋白质的时候,mRNA代谢活跃,总含量到达远高于一般生理水平的高峰值,尤其是异源mRNA的丰度都将超过总mRNA的50%以上。

mRNA介导的蛋白质合成机器就是核糖体。一段mRNA翻译周期包括起始、延伸、终止及核糖体再循环四个基本步骤。进化的经济性原则导致核糖体维持在适应一般生理水平的浓度,而通过四步循环利用的方式节约资源供应。核糖体不同阶段需要有不同因子参与其动作功能的实现。因核糖体机器的复杂性,各阶段的具体机制研究一直在持续。目前,已有众多结构生物学及分子生物学证据表明,真核细胞中ABCE1(或Rli1)参与了包括蛋白合成的起始、终止及核糖体再循环等重要阶段。在不同阶段,ABCE1通过与不同其他因子互作、构象变化,推动某一相应过程的进行。

酵母中ABCE1同系物Rli1(RNase L inhibitor 1)由RLI1基因编码,具有两个核酸结合结构域(NBDs)及N端铁硫簇结构域(FeS)。免疫共沉淀及删除研究表明,Rli1通过与多个因子互作参与起始复合体的形成,并Dom34一道在核糖体熄火拯救中也起类似核糖体翻译终止及再循环的作用。当前,对Rli1NBDs如协作与ATP的结合、ATP水解以参与终止、再循环及再起始等过程的精细机制仍旧未知,这也是对Rli1进行人工进化的一个出发点。

发明内容

本发明的目的在于克服现有策略的不足之处,提供一种提高酵母核mRNA翻译效率的方法,该方法提高了核糖体循环利用,缓解了过表达异源基因时导致的宿主内自由核糖体浓度受限问题;同时,考虑到Rli1所属ABCE1内各同系物在真核生物中进化相当保守,核糖体工作机制类似,因此,本发明提供的方法也适用于其他真核表达系统。

为实现上述目的,本发明采用的技术方案如下:

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