[发明专利]M8Sac71抗体及其制备方法与应用

权利要求书

1.一种M8Sac71抗体的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

(一)MARCH8 Sac71肽段的合成：制备MARCH8 Sac71肽段，该肽段的氨基酸序列如下所示：

Ac-T(Sac)ITPSSQDICRICHCEGDC-NH₂；

(二)MARCH8 Sac71肽段与BSA或KLH偶联：将上述合成的MARCH8 Sac71肽段与BSA或KLH偶联，得偶联产物；

(三)免疫兔子制备抗体，包括以下步骤：

(1)第一次免疫(0day)：用偶联产物免疫兔子，免疫方式为：四肢腹侧4处注射，每只兔子的用量为：400μg/只的偶联产物；

(2)第二次免疫(28day)：第28天，进行第二次免疫，免疫方式为：四肢腹侧4处注射，每只兔子的用量为：200μg/只的偶联产物；

(3)第三次免疫(49day)：第49天，进行第三次免疫，免疫方式为：静脉注射，每只兔子的用量为：400μg/只的偶联产物；

(4)采血：第59～61天，兔子耳缘静脉取血，经ELISA检测效价符合要求后，颈总动脉采血,制备血清；

(四)抗体的纯化：上述得到的血清，先利用非乙酰化肽段进行负筛选，再利用MARCH8Sac71肽段进行正筛选，得抗体，即为M8Sac71抗体；所述非乙酰化肽段的氨基酸序列如下所示：

Ac-TSITPSSQDICRICHCEGDC-NH₂。

2.根据权利要求1所述的M8Sac71抗体的制备方法，其特征在于：所述步骤(二)中，MARCH8 Sac71肽段与BSA偶联的具体方如下：

将BSA配成10mg/ml的溶液；sulfo-SMCC【4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐】用0.5×purification buffer配成10mg/ml的溶液，50℃孵育几分钟，使溶液澄清；

按0.5ml BSA+750μl sulfo-SMCC的比例配置偶联试剂，室温静置数分钟后，37℃孵育30min，期间轻轻振摇数次透析，用Conjugation buffer做透析液，透析1h，换透析液，再透析1h；透析结束后，小心将袋内液体吸到15ml离心管中，用Conjugation buffer补足到1.5ml，加入0.5ml的含有MARCH8 Sac71肽段的液体(肽段的浓度为10mg/ml)，混匀后，室温反应4h；

用Purification buffer透析1h，换透析液，透析过夜，吸出透析后偶联产物，用0.5ml的Purification buffer洗涤一次，合并于一个管中；偶联产物经适当稀释后，过滤除菌，分装，冻存于-80℃备用。

3.根据权利要求1所述的M8Sac71抗体的制备方法，其特征在于：所述步骤(三)(1)中，具体的免疫方式为：400μg/只偶联产物与弗氏完全佐剂按1:1混合，乳化，免疫兔子，免疫方式为：四肢腹侧4处注射。

4.根据权利要求1所述的M8Sac71抗体的制备方法，其特征在于：所述步骤(三)(2)中，进一步地，具体的免疫方式如下：取200μg/只偶联产物与弗氏不完全佐剂按1:1混合，乳化，免疫兔子，免疫方式为：四肢腹侧4处注射。

5.根据权利要求1所述的M8Sac71抗体的制备方法，其特征在于：所述步骤(三)(3)中，具体的免疫方式为：取400μg/只偶联产物与适量的PBS缓冲液混合，免疫兔子，免疫方式为：静脉注射。

6.根据权利要求1所述的M8Sac71抗体的制备方法，其特征在于：所述步骤(三)(4)中，所述经ELISA检测效价符合要求是指效价>1:1000或效价>1:10000。