[发明专利]M8Sac71抗体及其制备方法与应用

说明书

本发明公开了一种M8Sac71抗体，其制备方法为：(一)MARCH8Sac71肽段的合成：制备MARCH8Sac71肽段，该肽段的氨基酸序列如下所示：Ac‑T(Sac)ITPSSQDICRICHCEGDC‑NH₂；(二)MARCH8Sac71肽段与BSA或KLH偶联；(三)免疫兔子制备抗体；(四)抗体的纯化：上述得到的血清，先利用非乙酰化肽段进行负筛选，再利用MARCH8Sac71肽段进行正筛选，得抗体，即为M8Sac71抗体。本发明的M8Sac71抗体，通过dot‑blot和竞争性实验证明了M8Sac71抗体的特异性，并进一步证明与丝氨酸乙酰化酶YopJ共转的MARCH8乙酰化水平大大提高，印证了M8Sac71抗体的有效性，可应用于检测MARCH8上的71位丝氨酸位点是否被乙酰化。

技术领域

本发明涉及一种丝氨酸乙酰化抗体，具体涉及一种针对71位丝氨酸位点被乙酰化的MARCH8的抗体，及其制备方法与应用。

背景技术

MARCH8是一个由291个氨基酸组成的膜相关的E3泛素连接酶，可以靶向MHC II(HLA-DP，DQ，DR，HLA-DO，HLA-DM)]、共刺激分子CD86(B7-2)和CD8139]、黏附分子CD44、凋亡相关分子Fas(CD95)、Trail R、细胞运输分子TfR、IL-1receptor accessory protein等多种跨膜分子，通过泛素化、内吞作用及溶酶体降解途径下调这些分子的表面呈递，调控抗原提呈、T细胞活化、细胞凋亡与细胞运输。已知71位和75位丝氨酸(S)以及237位的酪氨酸(Y)是磷酸化位点，252位的赖氨酸(K)是泛素化位点，但MARCH8上是否有乙酰化位点尚未见报道。

本发明的发明人用质谱检测发现，MARCH8可以在71位、253位等多处丝氨酸位点被乙酰化，代表着MARCH8上的一种新的修饰形式，可能对MARCH8的功能有重要影响。但是如何证明这些乙酰化的存在，尚需制备针对这些位点的特异性抗体。

发明内容

针对上述现有技术，针对丝氨酸乙酰化抗体的缺乏，本发明提供了一种特异性好的M8Sac71抗体(所述M8Sac71是指71位丝氨酸位点被乙酰化了的MARCH8)，并设计了一套制备M8Sac71抗体的方法。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种M8Sac71抗体的制备方法，包括以下步骤：

(一)MARCH8 Sac71肽段的合成：制备MARCH8Sac71肽段(71位丝氨酸乙酰化肽段)，该肽段的氨基酸序列如下所示：

Ac-T(Sac)ITPSSQDICRICHCEGDC-NH₂；

同时，制备非乙酰化肽段(未修饰肽段)，该肽段的氨基酸序列如下所示：

Ac-TSITPSSQDICRICHCEGDC-NH₂。

(二)MARCH8 Sac71肽段与BSA(牛血清白蛋白)或KLH偶联：将上述合成的MARCH8Sac71肽段与BSA或KLH偶联，得偶联产物。偶联的具体操作步骤为常规技术手段。

优选的，MARCH8 Sac71肽段与BSA偶联的具体方法如下：

将BSA配成10mg/ml的溶液；sulfo-SMCC【4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐】用0.5×purification buffer配成10mg/ml的溶液，50℃孵育几分钟，使溶液澄清；