[发明专利]一种A型血友病慢病毒载体、慢病毒及其制备方法和应用

权利要求书

1.一种A型血友病慢病毒载体，其特征在于，所述慢病毒载体为在pTYF慢病毒载体的5’端的剪接供体位点进行改造，具体改造方式如下：

(a)其5’端的剪接供体位点被删除或改造，改造后的慢病毒载体剪接供体位点不是所述包装载体和所述参照慢病毒之间的同源重组的潜在位点；

(b)其仍具有病毒包装信号功能；

其中，所述慢病毒载体还包括FVIII和/或FVIII-BDD基因。

2.根据权利要求1所述的慢病毒载体，其特征在于，所述FVIII基因的核苷酸序列如SEQID NO.1所示或与其具有至少80％同源性，优选至少85％同源性，进一步优选至少95％同源性的核苷酸序列；

优选地，所述FVIII-BDD基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示或与其具有至少80％同源性，优选至少85％同源性，进一步优选至少95％同源性的核苷酸序列。

3.根据权利要求1或2所述的慢病毒载体，其特征在于，所述FVIII和/或FVIII-BDD基因之前还包括启动子序列；

优选地，所述启动子序列为EF1α和/或CMV，优选为EF1α；

优选地，所述EF1α的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示或与其具有至少90％同源性，优选至少95％同源性的核苷酸序列。

4.一种重组慢病毒，其特征在于，将包含如权利要求1-3中任一项所述的慢病毒载体pTYF与包装辅助质粒pNHP和pHEF-VSV-G共转染哺乳细胞得到的重组慢病毒；

优选地，所述哺乳细胞为HEK293T细胞和/或TE671细胞。

5.一种制备如权利要求4所述慢病毒的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)将慢病毒载体pTYF 5’端的剪接供体位点进行点突变；

(2)全基因合成启动子及FVIII和/或FVIII-BDD基因序列并插入步骤(1)点突变的慢病毒载体中；

(3)将构建的慢病毒载体与包装辅助质粒共转染哺乳细胞得到重组慢病毒。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述插入的位点为BamHI和SpeI酶切位点之间。

7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于，步骤(3)所述的包装辅助质粒为pNHP和pHEF-VSV-G；

优选地，所述哺乳细胞为HEK293T细胞和/或TE671细胞；

优选地，所述共转染哺乳细胞后的培养时间为24-72h。

8.一种重组细胞，其特征在于，所述重组细胞包括如权利要求1-3中任一项所述的慢病毒载体和/或如权利要求4所述的重组慢病毒；

优选地，所述重组细胞为重组干细胞，优选为外周血干细胞和/或间充质干细胞。

9.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括如权利要求1-3中任一项所述的慢病毒载体、如权利要求4所述的重组慢病毒或如权利要求8所述的重组细胞中的任意一种或至少两种的组合。

10.如权利要求1-3中任一项所述的慢病毒载体、如权利要求4所述的重组慢病毒、如权利要求8所述的重组细胞或如权利要求9所述的药物组合物在制备A型血友病治疗的药物和/或试剂中的用途；

优选地，所述组合物还包括药学上接受的辅料；

优选地，所述辅料为赋形剂、稀释剂、载体、调味剂、粘合剂和填充剂中的任意一种或至少两种的组合。