[发明专利]一种A型血友病慢病毒载体、慢病毒及其制备方法和应用

说明书

本发明提供一种A型血友病慢病毒载体、慢病毒及其制备方法和应用，所述慢病毒载体为在pTYF慢病毒载体的5’端的剪接供体位点进行改造，其中，所述慢病毒载体还包括FVIII和/或FVIII‑BDD基因。本申请改造后的慢病毒载体的基础上特异地连入FVIII和/或FVIII‑BDD基因，能够在保障安全性的同时实现更高效的基因传递，使得FVIII和/或FVIII‑BDD基因在骨髓相关细胞中的表达量明显增加，能够更高效的完成A型血友病基因治疗过程中正常基因的传递。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，涉及一种A型血友病慢病毒载体、慢病毒及其制备方法和应用，尤其涉及一种应用改良后的慢病毒载体优化表达FVIII和/或FVIII-BDD基因用于制备治疗A型血友病的药物。

背景技术

A型血友病(Hemophilia A)是一种由于X染色体连锁的凝血因子VIII(FVIII)基因突变造成的FVIII蛋白缺失或功能不全而引起的机体凝血功能障碍的出血性疾病。根据血浆中该因子的活性程度将疾病分为三种类型：严重(<1％)，中度(1％-5％)，轻度(5％-50％)。该病患者活性凝血活酶生成障碍，凝血时间延长，终身具有轻微创伤后出血倾向，重症患者即使没有明显外伤也可发生“自发性”出血，情况严重者可导致死亡。血友病的发病率为15/10万～20/10万，其中血友病A占85％且发病没有地域与种族间的差异

目前主要是依靠补充功能正常的FVIII蛋白来进行替代治疗(Replacementtherapy)，主要使用人血中提取或重组纯化的FVIII蛋白。然而该蛋白的来源血液制剂存在人免疫缺陷病毒(HIV)及肝炎病毒等病原污染的可能，虽然随着基因工程方法应用于因子的合成及纯化，感染传染病的风险被大大降低，但是病人持续性的替代治疗医疗费用十分高昂，并且需要终生治疗，生活质量低下。事实上，只要患者血浆中凝血因子活性少量增加(≥正常水平的2％)就可以显著改善病症，这使得基因治疗方法成为根治该病的一种可能，为A型血友病患者带来全新的希望。

在此之前已经有针对FVIII基因治疗相关的研究，其中有研究报道应用携带编码正常FVIII蛋白基因的慢病毒载体转染骨髓细胞，再将该骨髓细胞移植入FVIII敲除小鼠模型体内进行治疗。此报告中结果显示，在体外观察到了一定量的FVIII表达，但FVIII在体内的表达量小，没有表现出明显的治疗效果。因此如何更高效的实现FVIII基因在体内的传递与表达是实现A型血友病有效基因治疗的关键。

其后，WO/2017/083764公开了一种应用腺病毒相关病毒(AAV)载体携带FVIII-BDD(B domain deleted)基因治疗A型血友病的方法，因为FVIII基因中B结构域对其蛋白的正常功能没有明显的作用，因此删去后并不影响该蛋白的促凝血功能，并能够显著减小蛋白大小，降低免疫原性。该方法显示在哺乳动物细胞中能够较好的提高FVIII蛋白的表达量，因此可能会对临床A型血友病的临床效果有较好的提升。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供了一种A型血友病慢病毒载体、慢病毒及其制备方法和应用，所述A型血友病慢病毒载体转染效率更高，稳定性更强，安全性更好。

为达此目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供了一种慢病毒载体，所述慢病毒载体为在pTYF慢病毒载体的5’端的剪接供体位点进行改造，具体改造方式如下：

(a)其5’端的剪接供体位点被删除或改造，改造后的慢病毒载体剪接供体位点不是所述包装载体和所述参照慢病毒之间的同源重组的潜在位点；

(b)其仍具有病毒包装信号功能；

其中，所述慢病毒载体还包括FVIII和/或FVIII-BDD基因。