[发明专利]一种三碘甲状腺原氨酸酶结合物的制备方法

权利要求书

1.一种三碘甲状腺原氨酸酶结合物的制备方法，其特征在于：三碘甲状腺原氨酸酶结合物是由三碘甲状腺原氨酸衍生物（T3-NHS）与酶发生偶联反应生成，该反应不需要额外添加活化剂和偶联剂。

2.根据权利要求1所述的一种三碘甲状腺原氨酸酶结合物的制备方法，其特征在于：所述三碘甲状腺原氨酸衍生物为N-羟基琥珀酰亚胺(NHS) 和三碘甲状腺原氨酸的化学合成物质，其化学结构式为：

或者所述三碘甲状腺原氨酸衍生物为N-磺酸化羟基琥珀酰亚胺(Sulfo-NHS)和三碘甲状腺原氨酸的化学合成物质，其化学结构式为：

。

3.根据权利要求1或2所述的一种三碘甲状腺原氨酸酶结合物的制备方法，其特征在于：所述三碘甲状腺原氨酸衍生物是采用以工艺步骤制备的：

S1. 三碘甲状腺原氨酸-丁二酸酯的制备：取三碘甲状腺原氨酸加入到蒸馏水中，加入硫酸铜，在100℃水浴中回流反应5小时，冷却至室温后，过滤除去固体杂质，然后将滤液冰浴降温到结晶析出，用乙醇重结晶，得到白色片状结晶三碘甲状腺原氨酸-丁二酸酯；

S2. N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)与三碘甲状腺原氨酸合成物的制备：取上述三碘甲状腺原氨酸-丁二酸酯溶解于柠檬酸溶液中，加入N-羟基琥珀酰亚胺和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，避光条件下2～8℃反应8h，过色谱柱收集N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)与三碘甲状腺原氨酸合成物的洗脱液，浓缩后，用无水乙醇重结晶，得到白色针状结晶的三碘甲状腺原氨酸衍生物。

4.根据权利要求1所述的一种三碘甲状腺原氨酸酶结合物的制备方法，其特征在于：将三碘甲状腺原氨酸衍生物与酶按一定的比例加入到缓冲液中，避光反应一段时间，除去未反应完全的三碘甲状腺原氨酸衍生物，即得到三碘甲状腺原氨酸酶结合物。

5.根据权利要求4所述的一种三碘甲状腺原氨酸酶结合物的制备方法，其特征在于：所述的酶为碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、脲酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、葡萄糖氧化酶和苹果酸脱氢酶中的任一种，优选为碱性磷酸酶。

6.根据权利要求4所述的一种三碘甲状腺原氨酸酶结合物的制备方法，其特征在于：所述三碘甲状腺原氨酸衍生物与酶按照质量比为1:4～1:300加入到缓冲液中，优选的三碘甲状腺原氨酸衍生物与酶的质量比为1:50～1:200，最优选的为1:100～1:150。

7.根据权利要求4所述的一种三碘甲状腺原氨酸酶结合物的制备方法，其特征在于：所述缓冲液为EDTA 缓冲液、EGTA 缓冲液、柠檬酸盐缓冲系统、磷酸盐缓冲系统、醋酸盐缓冲系统、SSC 缓冲系统、SSPE 缓冲系统、2-(N-吗啉代) 乙磺酸(MES) 缓冲系统、哌嗪-N，N’双(2-乙磺酸)(PIPES) 缓冲系统中的任一种，优选为碳酸盐缓冲液。

8.根据权利要求6所述的一种三碘甲状腺原氨酸酶结合物的制备方法，其特征在于：所述缓冲液的PH值范围为7.5～10.5,优选的为7.8～9.0。

9.根据权利要求4所述的一种三碘甲状腺原氨酸酶结合物的制备方法，其特征在于：所述避光反应的温度为4℃～37℃，所述避光反应的时间为1～24小时。

10.根据权利要求4所述的一种三碘甲状腺原氨酸酶结合物的制备方法，其特征在于：除去未反应的三碘甲状腺原氨酸衍生物的方法为超滤法、透析法、脱盐柱法中的一种，优选为超滤法。