[发明专利]ALK基因融合检测引物、方法及试剂盒

权利要求书

1.ALK基因融合检测引物组，其特征在于，引物组的核苷酸序列为：

F1：AAACTACTGTAGAGCCCAC；

F2：CTAACTCGGGAGACTATGAAA；

F3：CAGACAAGCATAAAGATGTCAT；

F4：AAAATCAGTCTCAAGTAAAG；

F5：CCAGCAAAAATGTCAACTCGCG；

F6：CTGAATCCTGAAAGAGAAATAG；

F7：GCTCTCTGTGATGCGCTACTCAAT；

F8：AATTTACACATTTCAATTCATTCG；

F9：ATGATGGCTTCCAAATAGAAG；

F10：GCCAGAAGAGGGCATTCTGCA；

F11：AATAGGAATTGCTGTGGGAAAT；

F12：GTGAAGAACTAGTCCAGCTT；

F13：CGGCAAATCACAGATCGAAG；

F14：TGGTGTTGCTGAGGGCTGG；

R1：TTGGGGTTGTAGTCGGTCATG；

R2：TTTGCCAGTGTCAATTATATCTT；

R3：CTCAGGGCTCTGCAGCTCCATC；

F15：TTTGTTGGATTTGAAATTCCAGA；

R4：TTTTGCTTTTCCAGTTTCAC。

2.一种ALK基因融合检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒含有权利要求1所述的引物组。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，该试剂盒还含有检测探针组，其核苷酸序列如下所示：

P1：ACCGCCGGAAGCAC；

P2：CCCTGAGTACAAGCTG；

P3：AGGATATGCCCTTGA；

或者为该些序列的核苷酸反向互补序列。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述的探针序列5’端标记的荧光基团选自FAM、JOE、HEX、VIC、CY5、TET中一种，探针序列3’端标记的猝灭基团选自TAMRA、MGB、BHQ中一种。

5.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，该试剂盒还含有逆转录酶、逆转录缓冲液，实时荧光PCR反应缓冲液，DNA polymerase，dNTPs，阴性对照品，阳性对照品，引物F15、R4以及探针P3。

6.一种ALK基因融合检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)从样品中提取RNA；

2)将所提取的RNA进行逆转录反应，获得cDNA；逆转录体系中含有权利要求1所述的引物R1～R2；

3)以cDNA为模板，使用权利要求1所述的引物组和权利要求3所述的试剂盒中的检测探针组进行荧光定量PCR扩增反应并收集荧光信号；

4)结果分析：根据荧光信号判定样品是否存在相应的ALK基因融合类型；

上述方法不适用于疾病的诊断和治疗。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤2)中逆转录体系为：

8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤3)中，荧光定量PCR扩增反应体系分4个体系，分别为体系A～D，具体如下：

体系A：

体系B：

体系C：

体系D：

9.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于，步骤3)中所述的PCR扩增反应程序为：94～97℃、4～7min；93～96℃、13～17s，58～63℃、28～33s，71～73℃、13～16s，循环40～59次，同时收集荧光信号。

10.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于，步骤4)中结果分析如下：

①阳性：当阴性对照组无扩增曲线且特定阳性对照组具有明显的扩增曲线，检测样本的扩增曲线有明显的指数增长期，说明该样品存在ALK基因融合；

②阴性：当阴性对照组无扩增曲线且特定阳性对照组具有明显的扩增曲线，但检测样本无Ct值且曲线无明显的指数增长期，说明该样品不存在ALK基因融合类型或样本中ALK基因融合类型的含量低于权利要求2～5中任一项所述试剂盒最低检测限或为权利要求2～5中任一项所述试剂盒涵盖范围以外的ALK融合。