[发明专利]表面偶联心肌肌钙蛋白抗原的磁性高分子微球及其在检测血清中心肌肌钙蛋白中的应用

权利要求书

1.一种表面偶联心肌特异性肌钙蛋白抗原的磁性高分子微球，其特征在于：是取磁性高分子微球悬液1mL，其中微球的数量为1.074×10⁶～1.074×10⁷，悬液为PBS溶液，于洗涤缓冲液中磁吸洗涤，弃去上清杂质；再向其中加入20～500μL的活化缓冲液，振荡20～40s，充分混匀后静置3～10min，磁吸弃上清，重复活化步骤2～3次；再加入20～500μL的偶联缓冲液、5～50μL的EDC水溶液、5～50μL的NHS水溶液，于常温空气振荡培养箱孵育10～50min，磁吸弃去上清；再加入20～500μL的偶联缓冲液和300～600ng的cTnT抗原充分混匀，于空气振荡培养箱孵育1～3h，期间每隔10～20min取出EP管于漩涡混匀器混匀，磁吸弃上清，PBS洗涤2～3次；然后加入300～600μL的封闭液，于空气振荡培养箱孵育1～3h，期间每隔10～20min取出EP管于漩涡混匀器混匀；最后磁吸去上清，加入1mL的保存缓冲液于4℃冰箱保存，得到偶联cTnT抗原的功能化磁性高分子微球。

2.如权利要求1所述的一种表面偶联心肌特异性肌钙蛋白抗原的磁性高分子微球，其特征在于：磁性高分子微球为核壳式单分散聚苯乙烯磁性微球。

3.如权利要求1所述的一种表面偶联心肌特异性肌钙蛋白抗原的磁性高分子微球，其特征在于：EDC溶液为50mM的EDC水溶液，NHS溶液为50mM的NHS水溶液；活化缓冲液为50mM的吗啉乙磺酸水溶液，pH＝6.0；偶联缓冲液为50mM的吗啉乙磺酸水溶液，pH＝5.0；洗涤缓冲液是在PBS溶液中加入0.1％(v/v)Tween 20得到；封闭缓冲液是在PBS溶液中加入0.1％(v/v)Tween 20和1％(w/v)BSA得到；保存缓冲液是在PBS溶液中加入0.01％(v/v)Tween 20、0.1％(w/v)BSA和0.05％(w/v)Na₃N得到。

4.权利要求1所述的表面偶联心肌特异性肌钙蛋白抗原的磁性高分子微球在检测血清中心肌特异性肌钙蛋白中的应用。

5.如权利要求4所述的表面偶联心肌特异性肌钙蛋白抗原的磁性高分子微球在检测血清中心肌特异性肌钙蛋白中的应用，其特征在于：是依次于微型离心管中加入表面偶联心肌特异性肌钙蛋白抗原的功能化磁性高分子微球悬液8μL、100μL待测血清或者cTnT抗原标准品以及100μL一抗溶液，其中cTnT标准品的浓度为0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0和100.0ng/mL，于30～50℃振荡反应1.5～3.5h，期间每30min取出来于漩涡混匀器中混匀；之后，用PBS磁吸洗涤1～2次，加入100μL的荧光二抗溶液，于空气振荡器37℃孵育0.5～1.5h，600rpm；所有反应过程避光，保持荧光发光效率；取出磁吸离心，加入500μL的PBS溶液，上机检测；检测时，488nm激光激发微球表面的荧光二抗，在流式细胞仪的FL1通道检测微球表面荧光信号，收集门内细胞数量为5000～6000个，每个样品设置3个平行对照，从而获得标准品组以及待测血清样品组中微球表面荧光强度；然后以功能化微球-cTnT抗原复合物饱和偶联一抗溶液的检出荧光信号强度为阳性对照S_max，空白对照组的检出信号强度为阴性对照组S_min，依照公式R＝[(S_n-S_min)/(S_max-S_min)]，S_n为cTnT标准品或待测血清检出信号的强度，以R和标准品中cTnT抗原浓度制作标准曲线，进一步计算出血清样品中待检测cTnT抗原的浓度；其中，一抗为兔抗cTnT抗原的抗体，一抗溶液为一抗的磷酸盐缓冲液溶液；荧光二抗为异硫氰酸标记的山羊抗兔二抗，二抗溶液为二抗的磷酸盐缓冲液溶液。