[发明专利]多重实时荧光PCR快速检测术后颅内细菌感染的方法

权利要求书

1.一种多重实时荧光PCR快速检测术后颅内细菌感染的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

(1)提取病原菌样本的菌株混合DNA；

(2)配制荧光定量PCR反应液：Mg²⁺4mM、dNTP 0.3mM、10×Hot Start PCRbuffer、上下游引物各200nM、探针100nM、Hot Start Taq DNAPloymerase 3.5U；然后用EcoR I和DNase I酶切处理反应液；

(3)选取以下三组反应液对病原菌样本的菌株混合DNA模板进行荧光定量PCR检测；

第一组反应液中，引物和探针序列为：

上游引物：5’-AYAAACYGGAGGAAGGTG-3’，下游引物：5’-GATCCAARCGCARRTTCCG-3’；探针：G+探针：5’-FAM-TCAAATCATCATGCCCC-MGB，G－探针：5’-VIC-ATCATGGCCCTTACGACC-MGB；

第二组反应液中，包括以下三对引物和探针：

Ⅰ)上游引物：5’-ATTTATTACAATTAACGAAATGGGCA-3’，下游引物：5’-CAACACCCTGAACTTCACC-3’，探针：5’-FAM-ATTAACTGGATGGTACGCGCGAAGAATCGC-BHQ1-3’；

Ⅱ)上游引物：5’-TGGGTAGCGGAGAAATTCCAA-3’，下游引物：5’-AGTCCAAACAGTGCTCTACCTCCA-3’，探针：5’-JOE-CGCAGCGAAAGCGAGTCTGAATAGGG-BHQ1-3’；

Ⅲ)上游引物：5’-ACTCTTACGCAATCTAGCAGATG-3’，下游引物：5’-TGCAATACTCGTGCGTTTTAA-3’，探针：5’-TexasRed-CGAAAACGCTTGATACAGGGAGTTT-BHQ2-3’；

第三组反应液中，包括以下四对引物和探针：

Ⅳ)上游引物：5’-TCCTGCTGATTGACGATCACCC-3’，下游引物：5’-CCAGCGTTTCCAGACCGTTCAT-3’，探针：5’-JOE-CCAGATATCACCGTGGTTGGCGAA-BHQ1-3’；

Ⅴ)上游引物：5’-CGACGCCTGAAGCGTGACGAAC-3’，下游引物：5’-GGCTTGGTGATGTAGTCG-3’，探针：5’-FAM-CATGCTCACCGCCAAGG-BHQ1-3’；

Ⅵ)上游引物：5’-CTGATAGTTGAAGACGAACCCGT-3’，下游引物：5’-AAATGTCGCAAATCATCAGGTCC-3’，探针：5’-TexasRed-TGGCTGACCTCGCTGGGAGCAA-BHQ2-3’；

Ⅶ)上游引物：5’-GGGCGAAGAAGCAATTGCT-3’，下游引物：5’-GCGAGGCCGCTTACAGCAATG-3’，探针：5’-CY5-CATCGGTGGCGTAGAAACAAC–BHQ3-3’；

所述荧光定量PCR检测的步骤为：1)先用第一组反应液对混合DNA模板进行PCR检测；2)再采用第二组反应液和第三组反应液，按任意先后次序或同时对混合DNA模板进行PCR检测。

2.根据权利要求1所述多重实时荧光PCR快速检测术后颅内细菌感染的方法，其特征在于，步骤(3)中，以病原菌样本的菌株混合DNA和无菌水为模板，进行荧光定量PCR扩增，扩增程序为：95℃预变性5min后进行45个循环，每个循环包括95℃变性5s，60℃退火延伸90s。

3.根据权利要求1所述多重实时荧光PCR快速检测术后颅内细菌感染的方法，其特征在于，步骤(1)中，采用热裂解法提取病原菌菌株的DNA，所用的核酸提取液为：5％Chelex-100，0.5％NP-40，0.5％Triton X-100，1mM EDTA。

4.根据权利要求3所述多重实时荧光PCR快速检测术后颅内细菌感染的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述反应液与模板的体积用量比为9:1。