[发明专利]多重实时荧光PCR快速检测术后颅内细菌感染的方法

说明书

本发明提供了一种多重实时荧光PCR快速检测术后颅内细菌感染的方法，属于分子生物学技术领域。该方法采用多重荧光PCR技术对颅内外科手术发热病人脑脊液进行检测，实现了对多种常见颅内感染细菌进行分型检测。本发明的方法可实现快速检测术后颅内是否有细菌感染，能够快速鉴定外科手术后颅内感染患者常见的细菌类型，并解决了培养法不能鉴定新菌种和无法培养细菌的问题，其检测方法特异性和灵敏度高，降低了PCR检测的假阳性，缩短了检测周期，能够及早快速诊断颅内细菌感染，对于阻断临床感染和指导用药具有显著意义。

技术领域

本发明属于分子生物学和医学技术领域，涉及一种荧光检测方法，具体涉及一种多重实时荧光PCR快速检测术后颅内细菌感染的方法。

背景技术

颅内感染是神经外科开颅手术后常见的严重并发症之一，可引起神经系统功能的损害，其发生率约为2.6％～30％。一旦发生不仅严重影响患者的预后，而且症状不易控制，常常危及生命。由于颅内细菌感染常常波及脑、脊髓及邻近的解剖组织，患者常伴有高颅压、意识障碍、脑水肿、癫痫等症状，患者预后总体较差，病死率高达27.4％～39.2％，对其家庭和社会造成了严重的负担。而这些患者如能及时、正确的诊断其病原菌，多数会有良好的预后。因此，对开颅手术后脑脊液中细菌感染的病原菌进行快速而准确的检测和鉴定则显得十分重要。

中枢神经系统由于血脑屏障、脑膜、颅骨及头皮等组织保护，不易发生感染。尤其是血脑屏障的特殊保护作用，颅内感染的发生率低于机体其他系统，但开颅手术可使这些屏障遭到破坏，使脑组织与外界相通，因此增加了颅内感染的发生几率。姜绯等对579例开颅术后患者脑脊液细菌生长分布试验及药物敏感试验结果进行分析发现，脑脊液细菌培养阳性的细菌众多，前十五位依次为：凝固酶阴性葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、B群链球菌、类白喉棒状杆菌、粪链球菌、牛链球菌、绿色气球菌、洛菲不动杆菌、鲍曼不动杆菌、绿脓假单胞菌、大肠埃希菌、阴沟肠杆菌、产气肠杆菌和肺炎克雷伯菌。

在神经外科开颅手术后，患者高热为最常见症状，但是否存在颅内感染、是哪一类细菌感染是神经外科医生最为关心和急需解决的问题。颅内感染常见革兰氏阳性致病菌有金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、肺炎链球菌，革兰氏阴性致病菌有大肠埃希菌、绿脓假单胞菌、肺炎克雷伯菌和鲍曼不动杆菌。目前临床中尚无针对上述感染源的快速鉴定手段，而培养鉴定法周期较长，且感染源具有快速增殖的特性，无法准确用药的同时很容易延误治疗的最佳时机，造成病患的重大损失。如果能够开创一种能快速、精确诊断开颅手术后发热患者是否存在细菌感染，进一步定性病原菌种类的临床检测方法，将为临床医生合理用药提供有力依据。

目前在国内外大型医疗机构中，对开颅手术后颅内细菌感染的病原学检测方法并没有重大突破。国内外对于颅脑手术后颅内细菌感染的检测最常用方法仍然是：脑脊液病原菌染色镜检和培养，其中细菌培养法以其高特异性被作为“金标准”，但细菌培养法存在费时、敏感度低等缺点。细菌培养法首先需要至少8h的孵育，然后还需要一定时间进行生化或免疫学试验来鉴定细菌，影响其早期诊断及抗菌素的及时、有效使用。另外，乳胶凝集、免疫电泳、ELISA，以及脑脊液细胞计数和生化成份分析等实验技术虽各有特点，但普遍缺乏敏感性和特异性，难以满足临床要求，严重滞后于临床治疗，造成该类疾病的死亡率居高不下。

20世纪90年代以来，随着分子生物学飞速发展，为解决这一难题提供了条件，尤其是近几年出现的基因芯片技术，以其高度微型化、集约化，以及体积微小、操作方便、能同时特异检测多种生物分子等优点，在病原微生物的检测中有广阔的应用前景。但是，以往各类生物芯片因其高通量、商密度等特性应用主要局限于实验室的生命科学的基础研究和药物开发领域。近年来，以PCR技术为代表的分子生物学诊断技术，逐渐成为生物医学领域内最有价值的研究手段。各种PCR技术自建立以来，立即在病原菌诊断领域倍受瞩目，已经越来越多的应用于中枢神经系统(CNS)感染中病原菌DNA的扩增和检测，为细菌感染提供了早期、快速、敏感的检测手段。但一般普通PCR操作比较麻烦、而且容易污染。