[发明专利]一种可用于展示大量外源蛋白的重组质粒及构建方法和应用在审
| 申请号： | 201810553912.X | 申请日： | 2018-06-01 |
| 公开（公告）号： | CN109439681A | 公开（公告）日： | 2019-03-08 |
| 发明（设计）人： | 霍景瑞;刘英富;王蕾;刘颖;张晶晶;杨晓晖;田毅;吴楠 | 申请（专利权）人： | 沧州医学高等专科学校 |
| 主分类号： | C12N15/70 | 分类号： | C12N15/70;C12N15/66;C12N7/01;C12R1/92 |
| 代理公司： | 北京科亿知识产权代理事务所(普通合伙) 11350 | 代理人： | 汤东凤 |
| 地址： | 061000*** | 国省代码： | 河北;13 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 核苷酸序列 外源蛋白 重组质粒 构建 可用 细胞表面展示技术 应用 生物技术领域 开放阅读框 终止密码子 酶切位点 展示系统 氨基酸 质粒 展示 拓展 | ||
1.一种可用于展示大量外源蛋白的重组质粒，其特征在于，是以pET24a质粒为基础，在其开放阅读框内插入SEQ ID NO.1所示氨基酸对应的核苷酸序列，并在在该核苷酸序列后面插入SEQ ID NO.2所示的酶切位点与终止密码子的核苷酸序列。
2.如权利要求1所述的一种可用于展示大量外源蛋白的重组质粒，其特征在于，所述SEQ ID NO.1所示氨基酸对应的核苷酸序列为SEQ ID NO.3所示的10B蛋白序列。
3.如权利要求1所述的一种可用于展示大量外源蛋白的重组质粒，其特征在于，其构建方法包括以下步骤：
(1)噬菌体外壳蛋白10B基因的获得：以T7select415-1b噬菌体DNA为模板，在5’端引物和3’端引物的作用下PCR扩增编码10B蛋白的基因序列；
(2)构建重组质粒：分别以NdeI、XhoI酶切10B基因和pET24a载体，在目的基因连入pET24a后，酶切验证正确的载体，并将其命名为pET24a-10B-carrier；
(3)重组质粒的表达验证：分别将gfp基因、6×his-tag和flag-tag基因插入到上述重组质粒的10B基因3’端，并将其分别标记为pET-10B-GFP、pET-10B-his和pET-10B-flag，重组质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)后，经IPTG或乳糖诱导蛋白表达，Western Blot鉴定蛋白表达情况；
(4)重组质粒在噬菌体展示领域的应用：将步骤(3)中获得的表达菌，在IPTG或乳糖诱导2h后，向菌液中加入新鲜的T7-10-3b噬菌体，继续摇床培养1-1.5h，待菌液变澄清，利用PEG/NaCl沉降法收集噬菌体，点杂交法确认，噬菌体表面有相应的目标蛋白或者肽段展示，依次为GFP蛋白、His标签和Flag标签。
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