[发明专利]一种可用于展示大量外源蛋白的重组质粒及构建方法和应用

说明书

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种可用于展示大量外源蛋白的重组质粒及构建方法和应用，其可以拓展T7噬菌体展示系统在细胞表面展示技术方面的应用的；是以pET24a质粒为基础，在其开放阅读框内插入SEQ ID NO.1所示氨基酸对应的核苷酸序列，并在在该核苷酸序列后面插入SEQ ID NO.2所示的酶切位点与终止密码子的核苷酸序列。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种可用于展示大量外源蛋白的重组质粒及构建方法和应用。

背景技术

众所周知，细胞展示技术是以表达在细胞表面的蛋白为载体，通过基因工程操作将待展示的基因与细胞表面蛋白的表达基因融合，利用细胞自身的编码翻译系统将外缘蛋白展示在细菌或者酵母表面，从而赋予细胞以新的功能。目前，细胞展示技术已经成功应用在疫苗制备、肽库及抗体库的筛选、抗体生产等诸多领域。在抗体库的构建方面，pCANTAB-5E载体是应用最普遍的载体。但是SfiI、NotI核酸内切酶的最适温度不同，分步酶切造成的酶切效率低下和步骤繁琐是影响所构建文库库容的重要影响因素之一。

T7噬菌体展示系统能够用于高效展示从长度6-20氨基酸残基的小肽到大至300aa的蛋白；T7为烈性噬菌体，能够在1-2h完全裂解宿主菌，经PEG/NaCl法沉降能快速方便的收集。以往利用T7噬菌体进行展示，需要先将外源基因连接在T7基因组DNA的10B编码基因下游，然后将该基因用T7外壳蛋白包装，才能形成完整的T7噬菌体。鉴于T7基因组DNA较长，不易操作，而且T7外壳蛋白价格高昂，自行制备需要超高速离心机而且活性难以保证，所以应用T7噬菌体进行文库构建的难度极大。

基于细胞表面展示技术广泛应用以及T7噬菌体展示系统尚存的不足，构建一种可以展示大量外源蛋白的方法十分必要。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明目的在于提供一种可以拓展T7噬菌体展示系统在细胞表面展示技术方面的应用的可用于展示大量外源蛋白的重组质粒。

本发明的目的之二在于提供了所述可用于展示大量外源蛋白的重组质粒的制备方法。

本发明的目的之三在于提供了所述可用于展示大量外源蛋白的重组质粒在噬菌体展示方面的应用。

本发明的一种可用于展示大量外源蛋白的重组质粒，是以pET24a 质粒为基础，在其开放阅读框内插入SEQ ID NO.1所示氨基酸对应的核苷酸序列，并在在该核苷酸序列后面插入SEQ ID NO.2所示的酶切位点与终止密码子的核苷酸序列。

本发明的一种可用于展示大量外源蛋白的重组质粒，所述SEQ ID NO.1所示氨基酸对应的核苷酸序列为SEQ ID NO.3所示的10B蛋白序列。

本发明的一种可用于展示大量外源蛋白的重组质粒，其构建方法包括以下步骤：

(1)噬菌体外壳蛋白10B基因的获得：以T7select415-1b噬菌体DNA为模板，在5’端引物和3’端引物的作用下PCR扩增编码10B 蛋白的基因序列；

(2)构建重组质粒：分别以NdeI、XhoI酶切10B基因和pET24a 载体，在目的基因连入pET24a后，酶切验证正确的载体，并将其命名为pET24a-10B-carrier；

(3)重组质粒的表达验证：分别将gfp基因、6×his-tag和 flag-tag基因插入到上述重组质粒的10B基因3’端，并将其分别标记为pET-10B-GFP、pET-10B-his和pET-10B-flag，重组质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)后，经IPTG或乳糖诱导蛋白表达，Western Blot 鉴定蛋白表达情况；