[发明专利]一种铁线莲叶斑病致病菌的筛选方法

说明书

本发明公开了一种铁线莲叶斑病致病菌的筛选方法，取带有褐色坏死斑的成熟铁线莲叶片培养致病菌悬浮液；以加入100u/mL青霉素的PDA培养基制备初筛培养基；用无菌生理盐水稀释致病菌悬液成不同浓度，取1mL稀释液涂布于初筛培养基上，并在24～26℃条件下培养72～76h，获得致病菌落群；挑取初筛培养基上长出的菌落至含10％铁线莲汁的PDA培养基中进行纯培养，连续分离3～5次，获得的单一菌落即为铁线莲叶斑病菌落。本发明方法选择性强，分离效果好，纯化率高。

技术领域

本发明涉及一种园林植物病原菌分离方法，尤其涉及一种铁线莲叶斑病致病菌的分离方法，属于植物保护技术领域。

背景技术

铁线莲(Clematis florida Thunb.)为毛茛科铁线莲属植物，多为木质藤本，是攀援绿化中不可缺少的良好材料，有些铁线莲的花枝、叶枝与果枝，还可作为瓶饰、切花等。近年来，随着城市现代化建设的发展和城市规模的不断扩大，人们的生态意识和环境意识逐渐增强。园林绿化在城市环境中起着重要的作用。要提高城市的绿化覆盖率，改善城市的环境质量，不仅需要平面绿化，还要把平面绿化和垂直绿化有机的结合起来，因此铁线莲作为构成垂直绿化主体的藤本植物之一，可在园林绿化中充分发挥其优势。但铁线莲的叶斑病严重影响其观赏性，筛选并鉴定出导致铁线莲叶斑病的主要病原物，对建立有效的铁线莲叶斑病防治技术具有重要意义。

发明内容

发明目的：本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种铁线莲叶斑病致病菌的筛选方法，该方法分离周期短，纯化率高。

为解决上述技术问题，本发明所采用的技术手段为：

一种铁线莲叶斑病致病菌的筛选方法，包括如下步骤：

步骤1，致病菌悬液的制备：取带有叶斑的铁线莲叶片，切碎后置无菌生理盐水中，混合物溶液的浓度为20～25％，于一定温度下培养得到致病菌悬液；

步骤2，初筛培养基的制备：往PDA培养基中加入100u/mL青霉素，混合均匀后，灭菌，得到初筛培养基；

步骤3，致病菌落群培养：将步骤1中的致病菌悬液用无菌生理盐水梯度稀释成各个浓度的稀释液，每个浓度下取1mL稀释液涂布于步骤2的初筛培养基上进行培养，获得致病菌落群；

步骤4，单菌落培养：挑取初筛培养基上长出的菌落，接种至含铁线莲汁的培养基中进行纯培养，反复分：3～5次，获得的单一菌落为致病菌落；

步骤5：从初筛菌种中筛选出铁线莲叶斑病致病菌，再进行鉴定，确定致病菌的种类。

其中，步骤1中，致病菌悬液的培养条件为：于25℃，2500rpm振荡条件下培养30～35min。

其中，步骤2中，灭菌条件为121℃下灭菌25～30min。

其中，步骤3中，对致病菌悬液进行梯度稀释，得到的梯度稀释液浓度为10^-5、10^-6、10^-7。

其中，步骤3中，培养条件为24～26℃下培养72～78h。

其中，步骤4中，含铁线莲汁的培养基中，铁线莲汁的质量浓度为10～15％。

其中，步骤5中，筛选方法为培养基验证和铁线莲验证试验。

其中，步骤5中，致病菌的种属为：镰刀菌属、尖镰孢菌和链格饱属。

有益效果：本发明铁线莲叶斑病致病菌的筛选方法选择性强，分离周期短，纯化率高。

附图说明

图1为本发明方法分离获得的4类铁线莲叶斑病致病菌(真菌)菌落形态图。

具体实施方式