[发明专利]重金属活化微生物筛选方法

说明书

本发明公开了重金属活化微生物筛选方法，其包括以下步骤：采集样品，制备样品悬液，并于初筛培养基上培养一段时间后初步筛选出具有活化功能的初选菌株；将初选菌株置于纯化培养基中进行多次划线及分离纯化；将经步骤二纯化后的纯化菌株接种于复筛培养基上培养一段时间，根据透明圈直径D与菌落直径d计算（D‑d）/d比值，筛选得到所需的活化微生物；该筛选方法可以在前期处理大批量的采集样品，经初筛后大大缩小了所需菌的范围、缩短了筛选时间；其中，透明圈的大小在一定程度上反映该菌活化重金属能力的强弱，同时对比正常生长的微生物菌落，可在一定程度上反映菌株的镉耐性强弱，可为菌株的进一步深化研究提供参考。

技术领域

本发明涉及农业土壤金属活化微生物技术领域，具体涉及一种重金属活化微生物筛选方法。

背景技术

土壤重金属污染问题日益严重，且具有普遍性，是土壤环境污染治理中的热点、难点。重金属不能如有机物一样被微生物消化分解，只能在生态环境中迁移、转化，并不断积累，一旦重金属浓度积累到一定限值时，会对土壤植物系统产生毒害效应，进而通过食物链危害动物、人类的生命健康。重金属在土壤中的存在形态多样，主要可分为水溶态、交换态、碳酸盐结合态、铁锰氧化物结合态、有机结合态和残留态。例如，含Cd的化合物在土壤中会存在磷酸镉、碳酸镉、氢氧化镉等难溶性的结合态；含As化合物有砷酸钙、砷酸镁等难溶性砷化物等。

近年来，微生物一植物联合修复成为领域内的研究热点，由于其生态良性的优点而受到广泛关注，即通过微生物的代谢作用所产生的活性物质将土壤中的难溶态重金属活化，提高土壤重金属的有效性，进而促进修复超累积植物对有效态重金属的吸收，增强修复效率。

目前，活化重金属功能的微生物筛选方法主要通过摇瓶发酵测定有效重金属含量或与平板筛选相结合的方式进行筛选。如通过平板变色圈法筛选产酸菌，再通过摇瓶发酵将发酵液添加到污染土壤中，摇床培养后添加浸提剂，提取有效重金属，采用原子吸收法测定样品Cd、As、Zn浓度，比较供试菌株是否具有活化重金属效果；又如通过在难溶性磷酸盐培养基上是否有溶磷圈筛选目的菌株，进行分离纯化及鉴定，再通过向含碳酸镉、磷酸镉的液体发酵培养基中接种供试菌富集液的方式进行恒温震荡培养，培养液经离心后，用原子吸收分光光度计测定Cd²⁺含量。

但是现有技术中的上述方法都存在操作复杂的问题，因此现提供一种具有重金属耐性且操作快速的重金属活化微生物筛选方法。

发明内容

为此，本发明提供了一种重金属活化微生物筛选方法，重金属活化微生物筛选方法，其包括以下步骤：

步骤一、采集样品，制备样品悬液，并于初筛培养基上培养一段时间后初步筛选出具有活化功能的初选菌株；

步骤二、将初选菌株置于纯化培养基中进行多次划线及分离纯化；

步骤三、将经步骤二纯化后的纯化菌株接种于复筛培养基上培养一段时间，根据透明圈直径D与菌落直径d计算(D-d)/d比值，筛选得到所需的活化微生物。

在步骤一中，采用不同地区的重金属污染土壤作为样品，将样品和无菌水按一定比例混合均匀，制得样品悬液；其中，样品和无菌水之间满足以下比例关系：10.0～15.0g∶90～110mL。

在步骤一中，在制得样品悬液后，采用无菌水对样品悬液进行稀释，获得多种不同浓度的样品稀释液，然后将样品稀释液涂布在初筛培养基上进行培养。

在步骤一中，初筛培养基的配方原料包括10g/L的葡糖糖、5g/L的蛋白胨、5g/L的酵母粉、5g/L的氯化钠、1-10mL/L的Cd²⁺溶液、及1-10mL/L的PO₄^3-溶液或1-10mL/L的CO₃²-溶液或1-10mL/L的OH^-溶液，初筛培养基的pH值为6.5-7.5。