[发明专利]一种铁线莲叶斑病拮抗菌的筛选方法

权利要求书

1.一种铁线莲叶斑病拮抗菌的筛选方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤1，致病菌悬液的制备：取带有叶斑的铁线莲叶片，切碎后置无菌生理盐水中，混合物溶液的浓度为20～25％，于一定温度下培养得到致病菌悬液；

步骤2，取带有叶斑的铁线莲叶片，研磨后置于无菌水中，充分振荡后得到菌悬液；

步骤3，取1mL步骤2的菌悬液加入99mL无菌水中，按1∶10进行梯度稀释，得到10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5的稀释液；取100μL不同稀释梯度的稀释液均匀涂布于LB培养基平板上进行培养；

步骤4，用无菌滤纸在经步骤3培养后长出细菌的菌落上进行影印，然后接种至PDA培养基上培养，将步骤1的致病菌悬液喷至PDA培养基上，将PDA培养基密封好，并置于28℃下黑暗倒扣培养2～3d；

步骤5，筛选出PDA培养基中具有抑菌圈的细菌菌落，即为叶斑病拮抗菌。

2.根据权利要求1所述的铁线莲叶斑病拮抗菌的筛选方法，其特征在于：步骤1中，致病菌悬液的培养条件为：于25℃，2500rpm振荡条件下培养30～35min。

3.根据权利要求1所述的铁线莲叶斑病拮抗菌的筛选方法，其特征在于：步骤2中，其具体操作方法为：称取1g带有叶斑的铁线莲叶片，在无菌条件下研磨，研磨后加入100mL含玻璃珠的无菌水中，在30r/min摇床中振荡10min得到菌悬液。

4.根据权利要求1所述的铁线莲叶斑病拮抗菌的筛选方法，其特征在于：步骤3中，培养条件为：将LB培养基平板置于30℃下黑暗倒扣培养2d。

5.根据权利要求1所述的铁线莲叶斑病拮抗菌的筛选方法，其特征在于：将步骤5筛选出的叶斑病拮抗菌进行划线纯化，再对拮抗菌进行平板对峙实验。

6.根据权利要求5所述的铁线莲叶斑病拮抗菌的筛选方法，其特征在于：拮抗菌的分离纯化，采用如下方法：将所有抑菌圈内的拮抗菌挑出，分别置于LB平板中划线、纯化，将LB平板置于30℃培养箱中培养1d，使LB平板上长出单菌落，观察每个LB平板上单菌落的性状，如果有性状不一致的菌落，则需要再次重复划线纯化过程，直到每个LB平板中的菌落性状一致。