[发明专利]一种铁线莲叶斑病拮抗菌的筛选方法

说明书

本发明公开了一种铁线莲叶斑病拮抗菌的筛选方法，包括如下步骤：制备铁线莲叶斑病致病菌悬液；取带有叶斑的铁线莲叶片，研磨后置于无菌水中，充分振荡后得到菌悬液；取1mL菌悬液加入99mL无菌水中，按1∶10进行梯度稀释，得到10^‑1、10^‑2、10^‑3、10^‑4、10^‑5的稀释液；取100μL不同稀释梯度的稀释液均匀涂布于LB培养基平板上进行培养；用无菌滤纸在LB培养基上培养后长出细菌的菌落上进行影印，然后接种至PDA培养基上培养，将铁线莲叶斑病致病菌悬液喷至PDA培养基上，将PDA培养基密封好，并置于28℃下黑暗倒扣培养2～3d；筛选出PDA培养基中具有抑菌圈的细菌菌落，即为叶斑病拮抗菌。本发明筛选方法大大缩小了筛选对象的范围，减少了工作量，降低了成本，对促进拮抗菌的筛选，加快生防菌的开发利用，具有重要的应用价值。

技术领域

本发明涉及一种园林植物病生防菌的分离方法，尤其涉及一种铁线莲叶斑病拮抗菌的分离方法，属于植物保护技术领域。

背景技术

铁线莲(Clematis florida Thunb.)为毛茛科铁线莲属植物，多为木质藤本，是攀援绿化中不可缺少的良好材料，有些铁线莲的花枝、叶枝与果枝，还可作为瓶饰、切花等。近年来，随着城市现代化建设的发展和城市规模的不断扩大，人们的生态意识和环境意识逐渐增强。园林绿化在城市环境中起着重要的作用。要提高城市的绿化覆盖率，改善城市的环境质量，不仅需要平面绿化，还要把平面绿化和垂直绿化有机的结合起来，因此铁线莲作为构成垂直绿化主体的藤本植物之一，可在园林绿化中充分发挥其优势。但铁线莲的叶斑病严重影响其观赏性，筛选出铁线莲叶斑病的拮抗细菌，对开发铁线莲叶斑病生物防治技术具有重要意义。

发明内容

发明目的：本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种铁线莲叶斑病拮抗菌的筛选方法，该拮抗菌筛选方法能够缩小筛选对象的范围，从而有效减少筛选的工作量，提高筛选效率。

为解决上述技术问题，本发明所采用的技术手段为：

一种铁线莲叶斑病拮抗菌的筛选方法，包括如下步骤：

步骤1，致病菌悬液的制备：取带有叶斑的铁线莲叶片，切碎后置无菌生理盐水中，混合物溶液的浓度为20～25％，于一定温度下培养得到致病菌悬液；

步骤2，取带有叶斑的铁线莲叶片，研磨后置于无菌水中，充分振荡后得到菌悬液；

步骤3，取1mL步骤2的菌悬液加入99mL无菌水中，按1∶10进行梯度稀释，得到10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5的稀释液；取100μL不同稀释梯度的稀释液均匀涂布于LB培养基平板上进行培养；

步骤4，用无菌滤纸在经步骤3培养后长出细菌的菌落上进行影印，然后接种至PDA培养基上培养，将步骤1的致病菌悬液喷至PDA培养基上，将PDA培养基密封好，并置于28℃下黑暗倒扣培养2～3d；

步骤5，筛选出PDA培养基中具有抑菌圈的细菌菌落，即为叶斑病拮抗菌。

其中，步骤1中，致病菌悬液的培养条件为：于25℃，2500rpm振荡条件下培养30～35min，。

其中，步骤2中，其具体操作方法为：称取1g带有叶斑的铁线莲叶片，在无菌条件下研磨，研磨后加入100mL含玻璃珠的无菌水中，在30r/min摇床中振荡10min得到菌悬液。

其中，步骤3中，培养条件为：将LB培养基平板置于30℃下黑暗倒扣培养2d。