[发明专利]利用碱基编辑修复FBN1T7498C

说明书

本发明提供了一种利用碱基编辑修复FBN1^T7498C突变的试剂和方法。所述的高效修复FBN1^T7498C突变的试剂盒，其特征在于，包括碱基编辑系统以及针对FBN1^T7498C位点的修复re‑sgRNA。本发明利用碱基编辑技术，通过精准的CT单碱基突变，从而可以修复FBN1^T7498C的突变，从而为治疗该类突变引起的马凡氏综合征提供了高效安全的方法。

技术领域

本发明涉及基因修复领域，更具体来说，利用碱基编辑修复马凡氏综合征相关的FBN1^T7498C突变的方法。

背景技术

目前为止医学上已经鉴定出了接近一万种遗传病，对家庭和社会造成了巨大的负担，然而只有大约6％的遗传病目前可以治疗(Austin and Dawkins,2017)。诊断和治疗遗传病已经是医学上的重要研究内容。高通量测序技术的发展已经使得遗传病的诊断变得较为容易。虽然附植前遗传学诊断(PGD)可以阻断部分遗传病的发生，然而对一些诸如纯合突变等遗传病，尚需要开发更有效的遗传学治疗手段(Dunbar et al.,2018)。

基因编辑技术，尤其是CRISPR/Cas9，已经广泛应用于基因操作，并且可以应用于精准修复致病突变(Komor et al.,2017)。同时目前该技术在人胚胎上的基因编辑也展示出了巨大的优势，提示其在人遗传病治疗中的临床价值(Kang et al.,2016)。然而限于伦理和治疗的效率及脱靶的存在，基因编辑在人胚胎中的应用还有巨大的提升空间(Ruzoand Brivanlou,2017)。CRISPR/Cas9介导的基因编辑是在sgRNA(single guided RNA)通过靶序列互补引导Cas9蛋白定位剪切双链DNA，造成双链DNA断裂(double-strand breaks,DSB)，在没有模板的条件下，发生非同源末端连接(non-homologous end joining,NHEJ)修复，造成移码突变(frameshift mutation)，导致基因敲除(knockout)；在有模板的条件下，通过同源重组进行修复(homology-directed repair,HDR)，实现基因敲入(knockin)，由于HDR效率低(整合很少发生)，而且非同源性末端接合机制容易产生随机插入和删除(indel)，使得在断裂点附近可能随机引入新的碱基，从而导致不精确的基因编辑(Hsu etal.,2014)。此外，CRISPR/Cas9介导的基因编辑总有一些脱靶效应[Gorski et al.,2017]。

最近开发出来的碱基编辑系统，base editor，是在切口酶nCas9的基础上加上了大鼠的胞嘧啶脱氨酶APOBEC1，碱基编辑系统可以在不切割DNA双链的情况下，实现靶位点上C转化为尿嘧啶(Komor et al.,2016)。之后，通过DNA复制或修复，尿嘧啶被转化成胸腺嘧啶(T)，进而实现C到T的转换，类似地，其也能将单碱基G转化成A。由于不切割DNA造成DSB，形成的indel低于1％，实现的基因编辑更精确。碱基编辑系统已经被成功应用于体内碱基编辑，实现了小鼠的CT突变。

马凡氏综合征是一种常染色体显性遗传病，占世界人口的0.2‰，其主要造成人结缔组织的发育异常，目前已有多名知名运动员的猝死和马凡氏综合征有关(Arbustini etal.,2005)。虽然部分患者可以通过手术治疗，但对于后代仍然具有患病的风险，从遗传上治疗引起该病的突变将是根本的方法。前期已有表明FBN1基因的突变是造成马凡氏综合征的主因。因此能否找到高效同时安全性的治疗方法是我们追求的方向。

参考文献