[发明专利]一种砂梨叶片高效再生体系的建立方法及其应用

说明书

本发明公开了一种砂梨叶片高效再生体系的建立方法及其应用，包括以下步骤：（1）取砂梨的带芽枝条进行消毒，将带叶芽的茎尖接种于继代培养基上生长，再将未感染苹果茎沟病毒（Apple stem grooving virus,ASGV）的离体植株叶片切成小块叶片；（2）将外植体叶片接种于再生培养基中暗处理后再转至光下培养，产生不定芽，所述的再生培养基以NN69营养液为基础，再添加3‑5mg/L 6‑BA+0.1‑0.2mg/L NAA+2.5g/L植物凝胶；（3）待不定芽长至0.5~1.2cm，将其侧芽切下，置于继代培养基上培养获得再生苗。上述方法获得的组培苗离体叶片为无菌叶片，可用于病菌致病性测定，不受季节限制，保障了试验结果成功率和准确性。

技术领域

本发明属于生物技术及植物病害领域，具体涉及砂梨叶片高效再生体系的建立方法，还涉及组培苗离体叶片在病菌致病性评价方面的应用。

背景技术

砂梨(Pyrus pyrifolia)是我国南方广泛种植的重要落叶果树，梨生长不同周期均会受到的不同病害危害，如近年来发生普遍且严重的梨炭疽、梨黑斑叶部病害、梨轮纹枝干病害，不但影响梨品质和产量，还可导致梨树死亡、甚至毁园，给果农及梨产业带来严重的经济损失【田世平和范青，控制果蔬采后病害的生物学技术，植物学通报，2000，17(3)：211-217】。梨轮纹病在我国梨产区分布广泛，是我国梨树的重要病害之一。该病主要为害梨树枝干、果实和叶片，枝干受害可促使树枝早衰，叶片受害会引起叶片早落，果实受害能造成大量烂果，严重影响产量和品质【田路明,周宗山,董星光,曹玉芬,张莹.梨轮纹病研究进展[J].中国果树,2013(04):74-77】。梨黑斑病和梨炭疽病是危害梨树叶片的主要病害，病原菌可侵染幼嫩叶片、新梢以及幼果，发病严重时会导致梨树落叶，严重影响果品产量【王宏，常有宏，陈志谊.梨黑斑病病原菌生物学特性研究.果树学报，2006，23(2):247-25；沈静霆.砀山酥梨炭疽病菌生物学特性及有效药剂筛选[D].安徽农业大学,2012】。另外，梨树通常复合感染多种病毒，主要是苹果茎沟病毒(Apple stem grooving virus,ASGV)、苹果褪绿叶斑病毒(Apple chlorotic leaf spot virus,ACLSV)和苹果茎痘病毒(Apple stempitting virus,ASPV)，不仅削弱树势,导致产量和果实品质下降，严重限制我国梨的生产【邓晓云,王国平.梨病毒病研究新进展[J].果树学报,2002(05):321-325】。为了防治梨树病毒病并获得高品质的梨，常采用梨树无毒化栽培模式，通过茎尖及热处理等不同方式获得无毒材料【洪霓,王国平,张尊平,董雅凤,薛光荣.梨病毒脱除技术研究[J].中国果树,1995(04):5-7】。除以上梨感染病害因素外，梨树品种退化问题也是阻碍梨产业快速发展的一个重要因素。

筛选抗病、抗逆基因，将药物高效用于植物病害防控实践应用中，是防治梨病害的根本途径，可提高果品产量和品质【王苏珂,李秀根,杨健,王龙,薛华柏,苏艳丽,王磊.我国梨品种选育研究近20年来的回顾与展望[J].果树学报,2016,33(S1):10-23】。梨树生长周期长，通过转基因技术转入目的基因，获得转基因植株，植株的抗逆性、抗病性以及生长长势、果品质量将会有效提升。开展梨组培遗传转化研究是筛选并探究梨基因在抗病育种中的功能作用的主要途径。建立不同品种梨树叶片离体高效再生体系是梨遗传转化的关键环节，同时也是进行离体植株快速繁殖的有效途径。建立梨叶片再生培养为工厂化育苗，建立无性快繁提供依据和材料，是进一步实现梨的无毒化栽培和提高梨的果品质量的有效途径。因此，高效不同品种梨离体叶片再生体系的建立旨在为解决梨品种退化以及病害干扰，建立梨品种的种质创新的绿色产业健康发展均提供有效的解决途径。