[发明专利]一种自组装的纳米佐剂及由该佐剂形成的纳米疫苗的制备方法与应用

说明书

本发明涉及一种自组装的纳米佐剂及由该佐剂形成的纳米疫苗的制备方法与应用。该发明包括以鱼精蛋白硫酸盐和羧甲基葡聚糖为自组装材料，与CpG寡脱氧核苷酸一起自组装形成的纳米佐剂及由该纳米佐剂与病毒抗原形成的纳米疫苗。纳米佐剂提高了CpG寡脱氧核苷酸的生物利用率，避免其在体内降解，并且使B型CpG增加了A型CpG的功能。纳米疫苗不仅可以诱导TH1型的体液免疫反应，同时还能诱导较强的细胞免疫反应。通过小鼠体内攻毒实验证实纳米疫苗具有很好的保护作用，为今后纳米疫苗的应用提供了帮助。

技术领域

本发明属于纳米材料生物学领域。本发明涉及一种自组装形成的纳米佐剂及由该佐剂形成的纳米疫苗，具体涉及以鱼精蛋白硫酸盐和羧甲基葡聚糖为自组装材料，与CpG寡脱氧核苷酸一起自组装形成的纳米佐剂及由该纳米佐剂与病毒抗原形成的纳米疫苗的制备方法与应用。

背景技术

病毒疫苗包括减毒活疫苗、灭活疫苗、亚单位疫苗。灭活病毒由完整的病毒组成，人为使其致病性丧失或减弱，但仍保持病毒的全部或部分免疫原性，接种后病毒抗原可以刺激机体产生免疫应答，达到保护作用。由于其存在免疫效果差，不能诱导CTL反应，诱导产生的免疫反应持续时间短，需要多次接种等缺点，需要在免疫的同时加入免疫佐剂。应用于灭活疫苗的佐剂一般为铝佐剂。铝佐剂可以增强初次免疫，减少每次免疫抗原的用量以及免疫次数，但是对于嗣后加强免疫效果较小，且可能发生多种不良反应。弗氏佐剂又分弗氏不完全佐剂和完全弗氏佐剂，是目前动物实验中最常见的佐剂，但易在注射局部形成肉芽肿和持久性溃疡，因此不适用于人体使用。所以寻找一种现有佐剂的免疫增强佐剂显得尤为重要。

CPG ODN(CpG oligonucleotide,CpG寡脱氧核苷酸)是人工合成的含有非甲基化的胞嘧啶鸟嘌呤二核苷酸(CpG)的寡脱氧核苷酸(ODN),可模拟细菌DNA刺激多种哺乳动物包括人的免疫细胞。它能直接激活B细胞和单核细胞(巨噬细胞和树突状细胞),间接激活NK细胞和T细胞等多种免疫效应细胞,增强其功能和细胞因子的分泌,增强抗原的加工提呈,诱导Th1型免疫应答,产生较强的体液免疫和细胞免疫,增强特异性和非特异性免疫反应。CPG ODN是一种很有前景的免疫佐剂，但是由于其容易在体内聚集、降解，所以它的应用受到了一定的限制。

纳米颗粒的生物学特性之一是容易被多种细胞摄取。由于纳米颗粒在维度上与微生物相当，它们能够更好地被抗原递呈细胞吞噬，把抗原更多地带入到细胞中，从而增强蛋白和多肽引起的免疫响应。纳米颗粒还可以增加小分子抗原的尺寸，并对其表面进行修饰。同时，某些类型的纳米颗粒自身对免疫系统就具有刺激作用。因此，纳米颗粒有可能发展成为一类新型的纳米佐剂。将纳米颗粒作为疫苗的佐剂，一方面可以利用其载体性质来提高抗原递呈细胞对抗原的吞噬能力，另一方面，可以利用其对免疫细胞的作用来触发机体的固有免疫响应，并最终诱导有效的特异性免疫响应。

发明内容

本发明提供一种自组装的纳米佐剂及由该佐剂形成的纳米疫苗的制备方法。该纳米佐剂可以极大增强疫苗免疫效果，包载病毒抗原后可以减少疫苗的使用量，增加细胞因子的分泌，而且制备方法简单易行，适合大规模生产。

为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明提供一种纳米佐剂，所述的纳米佐剂的自组装材料为羧甲基葡聚糖和鱼精蛋白硫酸盐，在自组装过程中加入CpG寡脱氧核苷酸形成纳米佐剂。本发明提供的纳米佐剂，能够高效率地包载CpG寡脱氧核苷酸，解决CpG寡脱氧核苷酸易在体内降解，生物利用率低的问题。

所述羧甲基葡聚糖为水溶性羧甲基修饰的葡聚糖衍生物，是生物相容

性好、生物可降解和代谢的天然高分子材料，其取代度>50％,分子量为20-110KDa。羧甲基葡聚糖具有良好的生物相容性，同时能够避免血浆中负电性蛋白的吸附，增长体内的循环时间。

所述的鱼精蛋白硫酸盐来源于鲑鱼。

所述CpG寡脱氧核苷酸为任意人或鼠特异性CpG寡脱氧核苷酸。