[发明专利]一种鉴别CCoVI和CCoVII的双重纳米PCR检测方法

说明书

本发明公开了一种鉴别CCoVⅠ和CCoVⅡ的nanoRT‑PCR检测方法。通过对nanoRT‑PCR反应体系的引物、退火温度和引物浓度进行优化，获得CCoVⅠ和CCoVⅡ各自的目的条带的高效扩增，同时避免引物间的非特异性扩增；本发明所述nanoRT‑PCR检测方法的最低核酸检测量比普通RT‑PCR高100倍，且通过nanoRT‑PCR扩增得到与预期片段大小一致且序列完全正确的产物。本发明提供的用于鉴别CCoVⅠ和CCoVⅡ的nanoRT‑PCR方法具有极高的灵敏度和特异性，是一种高效的检测手段，可应用于犬冠状病毒病的流行性调查，同时也为CCoV的鉴定和防控奠定基础，具有重大的实际意义和价值。

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体涉及一种鉴别CCoVI和CCoVII的双重纳米RT-PCR检测方法及其应用。

背景技术

犬冠状病毒(Canine coronavirus，CCoV)是引起犬胃肠炎的主要病原之一，一般引起幼龄犬发生非致死性的轻度腹泻，呈现高发病率、低死亡率的特点，当与其他肠道病原混合感染时，能导致患病动物高死亡率。近年来，随着CCoV高致病性的变异毒株在欧洲国家陆续报道，该病再一次引起了广泛的关注[1-2]。

CCoV为单股正链RNA病毒，属套式病毒目、α冠状病毒科、α冠状病毒属[3]。近年来检测到CCoV有不同的基因型，分为CCoV I型(CCoVI)和CCoVⅡ型(CCoVII)[4]。CCoVⅡ是自1971年以来已知的最早的基因型[5]，由于CCoVI尚未适应体外生长，不能通过细胞培养分离得到，依靠分子方法才在30年后被发现[6]。CCoV基因组序列包括10个开放阅读框，从5′到3′依次编码1a、1b、纤突蛋白、小膜蛋白、膜蛋白(M)、核衣壳蛋白以及许多假定的非结构蛋白。对CCoV M基因的氨基酸序列进行比对分析，在CCoVⅡ跨膜区和羧基末端，只有少数分散的替换，而CCoV I的M蛋白中发生许多类似于猫冠状病毒典型残基的替换，基于此可以区分I型和Ⅱ型[7]。由于冠状病毒不仅在宿主中易突变，而且在病毒间也易发生基因重组，从而导致近年来新变异株不断出现。另外，CCoVI和CCoVⅡ的感染在临床诊断上是无法区分的，只能依靠生物技术对其进行序列分析后才能得到鉴别，所以建立一个简便有效、特异性高和灵敏性强的检测方法很有必要。

目前，检测CCoV的技术主要有普通RT-PCR、核酸探针、荧光定量RT-PCR及ELISA等：(1)RT-PCR是比较常见的技术，但其缺陷在于敏感性不显著；(2)核酸探针技术费用较高，不适用于大批量样本的检测；(3)荧光定量RT-PCR的敏感性和准确性高于普通RT-PCR，但其实施需要昂贵的实时荧光定量PCR仪，在二三线城市的动物诊所或实验室难以普及推广；(4)间接ELISA法对样品的要求比较高，且操作程序复杂，耗时长。以上这些缺点限制了上述方法在临床诊断中的应用。

纳米PCR是一种敏感、便捷的新型PCR技术，其原理是在纳米PCR缓冲液中添加了粒径为1nm～100nm的纳米金属颗粒，当反应时产生具有超强导电性的纳米流体，从而加快温度升高和下降的速度，减少在非目标温度的停留时间，因而减少了反应非特异性扩增，同时提高了扩增效率和敏感性。该方法目前仍未适用于犬科病毒，尤其是CCoVI和CCoVII的鉴定检测当中。

参考文献：

[1]Zicola A，Jolly S，Mathijs E，et al.Fatal outbreaks in dogsassociated with pantropic canine coronavirus in France and Belgium[J].SmallAnim.Pract，2012，53:297–300.18.

[2]Decaro N，Cordonnier N，Demeter Z，et al.European surveillance forpantropic canine coronavirus[J].Clin Microbiol，2013，51(1):83–88.